miR-223-3p 和MMP-9 联合检测在川崎病冠状动脉病变早期诊断中的临床价值

王 丽,赵洋洋,高 燕,高吊清,贾旭林,刘 菲,杨蕊华,阴怀清

川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种急性、发热性血管炎疾病,最常见于5 岁以下的儿童,它能够影响多个系统,尤其心血管系统,是小儿获得性心脏病的主要原因,并增加了成年后心肌梗死的风险[1]。KD 主要影响中小血管,易侵犯冠状动脉,如果不能早期诊断并予以治疗,则25%的病人可能会发展为冠状动脉病变,如冠状动脉扩张、冠状动脉瘤、冠状动脉狭窄甚至猝死[2-3]。基于KD 可能引起对冠状动脉的损害作用,因此,寻找可靠生物标志物早期发现KD 冠状动脉损伤,并及时予以治疗,以改善病人预后具有重要意义。有研究发现,miRNA 具有强大的生物学功能,在许多生物学过程和疾病(包括KD)中起关键作用,其中miR-223-3p 可能与KD 患儿血管内皮细胞损伤有关[4]。近年来,基质金属蛋白酶(MMP)是一种由多种细胞产生的酶,能够降解细胞外基质[5-6]。过度表达和激活MMPs 可诱导组织破坏,在多种疾病中起重要作用,包括类风湿关节炎、牙周疾病、癌症和动脉粥样硬化[5-7]。MMP-9 是 MMP 家族中的重要成员之一,MMP-9 可能与炎症性血管病变发生有关,并且可能参与了KD 患儿冠状动内皮细胞损伤的过程,从而引起了临床对KD血管损害的重视[8]。本研究检测KD患儿血清miR-223-3p 和MMP-9 的表达水平,为早期发现KD 合并冠状动脉病变及病情评估提供可靠的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 KD 组:选取2018 年8 月—2019 年8月于山西省儿童医院小儿心血管内科收治的KD 患儿80 例。病例纳入标准:符合日本KD 研究委员会第四次修订的诊断标准[9],为急性期的患儿。排除1 周内应用过丙种球蛋白(IVIG)及除外出现IVIG 不良反应等状况的患儿,排除其他急性发热出疹性疾病、先天性心脏及血管疾病等,发病年龄为2 个月至7 岁;男58例,女22 例。根据心脏彩超显示的冠状动脉病变分级标准[10],将其分为心血管受累组和心血管未受累组。心血管受累组20 例,年龄(1.36±0.81)岁,男12 例,女8 例;心血管未受累组60 例,年龄(1.58±0.65)岁,男42 例,女18 例。对照组:随机选取我院门诊常规体检的30 名健康儿童(除外先天性心脏及血管疾病),年龄3 个月至8 岁。KD 组与对照组年龄、性别比较差异均无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。

1.2 标本采集 KD 患儿分别采集入院后且使用药物治疗前和经过IVIG 治疗1 周后的血液标本,所有病人采集清晨空腹静脉血,经EDTA-K2抗凝,离心后(3 000 r/min)的血浆转入EP 管,保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 仪器与检测方法 miR-223-3p 检测采用Real-time法,使用7500 fast 定量聚合酶链式反应(PCR)仪(美国ABI),试剂购自中国吉玛公司;通过瑞典Anthosht2 酶标仪检测MMP-9 水平,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定,试剂盒购自美国R&D 公司。C-反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)和白细胞计数(WBC)使用OLYMPUS 公司生产的生化分析仪AU2700 检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差(±s)表示,不符合正态分布则采用中位数和四分位间距(interquartile range,IQR)表示;计数资料以率表示。计量资料满足正态分布采用t检验或者方差分析;不满足正态分布则采用基于秩次的非参数检验。计数资料采用四格表或者R×C 列联表χ2检验。多因素分析采用非条件Logistic 回归模型。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3 组急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比较 心血管受累组、心血管未受累组急性期(静脉注射IVIG 治疗前1～10 d)miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);心血管受累组急性期miR-223-3p 水平低于心血管未受累组,急性期MMP-9、CRP、ESR、WBC 水平均高于心血管未受累组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 3 组急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比较(±s)

表1 3 组急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比较(±s)

与对照组比较,①P ＜0.05;与心血管未受累组比较,②P ＜0.05。

组别 样本量 miR-223-3p MMP-9(pg/mL) CRP(mg/L) ESR(mm/h) WBC(×109/L)心血管受累组 20 3.21±0.01①② 789.38±94.70①② 48.39±12.59①② 89.34±21.46①② 20.43±8.38①②心血管未受累组 60 4.26±0.01① 280.20±66.18① 26.58±6.44① 24.47±12.52① 15.87±5.47①对照组 30 0.98±0.01 80.40±43.75 0.35±0.01 16.48±5.47 9.48±4.93

2.2 KD 患儿经IVIG 治疗前后miR-223-3p、MMP-9水平比较 心血管受累组经IVIG 治疗1 周后血浆miR-223-3p 和MMP-9 水平较治疗前明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);心血管未受累组IVIG 治疗前后血浆miR-223-3p水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);心血管未受累组IVIG 治疗后血浆MMP-9水平较治疗前明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表2。

表2 KD 患儿经IVIG 治疗前后miR-223-3p、MMP-9 水平比较(±s)

表2 KD 患儿经IVIG 治疗前后miR-223-3p、MMP-9 水平比较(±s)

与同组治疗前比较,①P ＜0.05。

组别 例数 miR-223-3p MMP-9(pg/mL)治疗前 治疗后治疗前 治疗后心血管受累组 20 3.21±0.01 1.39±0.02① 789.38±94.70 205.62±39.43①心血管未受累组 60 4.26±0.01 4.18±0.02 280.20±66.18 110.50±29.28①

3 讨 论

近年来,KD 发病率出现逐年升高的趋势,KD 易累及心血管系统,特别是冠状动脉,严重影响预后,成为成人冠心病的重要危险因素[11]。目前KD 发病机制尚未明确,诊断主要依靠临床症状、体征和心脏超声及实验室检查,但不能早期发现冠状动脉损伤。探讨KD的发病机制并寻找早期反映KD 冠状动脉损伤的血清学指标,对KD 的临床诊治至关重要。

miRNA 是一类非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3’UTR 或CDS 序列配对,直接或间接地抑制mRNA的翻译,在许多生理过程中表现出强大的调节作用,包括细胞代谢、增殖、分化和凋亡[12]。miRNA 的异常表达已被证实与人类各种疾病,包括癌症、心血管疾病和炎性病症相关[13-14]。有研究报道,骨髓源的miR-223可作为血管内皮细胞的内分泌遗传信号,能够进入血管内皮细胞,具有调节其增殖、凋亡等作用[15]。最近的研究表明,miR-223 参与慢性肾脏病(CKD)实验小鼠动脉粥样硬化的发展[16]。还有研究发现,miR-223作为胰岛素样生长因子1 的受体,可以促进人脐静脉内皮细胞凋亡[17]。这均表明miR-223 可能与心血管疾病的发生有关。miR-223-3p 由miR-223 的3"端臂产生[18]。白细胞介素-6(IL-6)被确认为miR-223-3p的靶基因,IL-6 / STST3 信号通路在炎症反应中起着至关重要的作用[19]。KD 是引起儿童多系统血管炎的重要发热性疾病,miR-223-3p 很可能参与了KD 引起的血管炎性过程。

KD 是儿童全身性血管炎的最常见原因,全身中小动脉均可受累,其中为心脏提供血液的冠状动脉最易受累,其病理改变的基础主要是免疫系统异常激活导致炎性细胞形成透壁性炎性反应,从而导致细胞外基质降解,血管内皮细胞功能紊乱,进一步导致中膜变薄直至弹性内膜的破坏,最终形成冠状动脉损伤,而上述病理过程均与MMP 家族有关[8]。MMP 是一种由多种细胞类型产生的酶,能够降解细胞外基质[5-6]。过度表达和激活MMP 可诱导组织破坏,并且还与许多特定疾病(包括类风湿关节炎、牙周疾病、癌症和动脉粥样硬化)相关[5-7]。大多数MMP 可以裂解几种类型的基质成分,并可能降解重叠的底物,例如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。在MMP 家族中,MMP-2(72 kDa形式)和MMP-9(92 kDa 形式)具有特殊弹性分解活性[20-21]。MMP-9 可能与炎症性血管疾病发病机制有关,通过降解内部弹性板层,例如巨细胞动脉炎[22]和颞动脉炎[23]。在KD 患儿合并冠状动脉损伤时血液中MMP-9 增加,可通过损伤内皮间隙弥散至内皮下并被激活,造成基底膜屏障、内皮下弹力纤维层的破坏[8]。

本研究结果显示,心血管受累组和心血管未受累组急性期miR-223-3p、CRP、ESR、WBC 水平均高于对照组(P＜0.05);心血管受累组急性期CRP、ESR、WBC 水平均高于心血管未受累组(P＜0.05),miR-223-3p水平低于心血管未受累组(P＜0.05),心血管受累组经IVIG 治疗1 周后血浆miR-223-3p 水平较治疗前明显下降(P＜0.05),提示miR-223-3p 可早期反映KD冠状动脉损伤,对血管内皮细胞损伤起到保护作用。

本研究结果显示,心血管受累组和心血管未受累组急性期MMP-9 水平均高于对照组(P＜0.05);心血管受累组急性期MMP-9 水平高于心血管未受累组(P＜0.05),提示MMP-9 的增高可能在血管炎性损伤尤其是冠状动脉损伤中发挥重要作用。在使用IVIG 治疗后,心血管受累组血清MMP-9 水平虽然较治疗前明显下降,但仍高于对照组,表明KD 患儿治疗后虽临床症状改善,但其冠状动脉的炎性病理损伤过程可能依然存在。

综上所述,通过对miR-223-3p 与MMP-9 的联合检测,发现miR-223-3p、MMP-9 可能与KD 冠状动脉损伤相关,有望作为识别KD 患儿冠状动脉早期损伤的指标。