广泛性焦虑对心肌梗死大鼠心房及外周血心房利钠肽水平的影响

陈雅丽,侯季秋,王 威,靳会会,安 莹,王 超,唐卓然,黄乐曦,贾静芸,赵海滨

焦虑是人类面临压力、应激时出现的一种正常情绪反应状态,由于社会及生活的巨大压力,人类精神、情绪长久受抑,最终发展为焦虑、抑郁症。自精神疾病备受关注以来,其发病率高、患病人群广[1-2]、合并症多[3-4]、工作障碍[5-6]的形势,已经广泛影响人们的身心健康及生活。近年流行病学研究显示,20%～42%心血管人群合并焦虑,焦虑作为心血管疾病的独立危险因素,36%的冠心病心血管不良事件与焦虑有关[7-9]。焦虑能影响冠心病的预后,但焦虑对冠心病的影响尚处于探索阶段。心房利钠肽(ANP)在心脏和中枢神经系统中都发挥着作用[10],但心肌梗死与焦虑的联系尚未明确。目前,关于ANP 在心肌梗死合并焦虑方面缺乏相应的实验研究,本研究旨在初步探索焦虑对心肌梗死大鼠外周血及ANP 的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级6 周龄健康雄性SD 大鼠22只,体重180～200 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,生产许可证编号:SCXK(京)2012-0001。本实验取得北京中医药大学伦理委员会批准,动物饲养于北京中医药大学SFP 级动物房,喂常规大鼠饲料及饮用水。

1.2 主要试剂及仪器 大鼠ANP 酶联免疫试剂盒(目录号:E02A0493,BlueGene);兔多抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)检测抗体(AB-P-R 001);兔多抗ANP(27426-1-AP);兔多抗钠尿肽受体A(NPRA,27426-1-AP);辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗(BA1054)。

小动物呼吸机(上海奥尔科特生物技术有限公司),小动物超声影像系统(加拿大Visual Sonics 公司),标准规格酶标仪(Thermo Scientific 公司,型号:Multiskan MK3),自动洗板机(北京拓普分析仪器有限公司,型号:DEM-3),离心机(美国 Sigma,型号:3K18)。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 依据前期造模研究基础[11],采用不确定空瓶刺激法结合冠状动脉左前降支结扎建立心肌梗死合并焦虑模型。

1.3.1.1 广泛性焦虑模型 参照文献及前期研究[11-12],采用不确定空瓶刺激法。造模周期21 d,造模期间大鼠自由摄食。前7 d 采用定时喂水训练,每日08:30～08:40 和晚上20:30～20:40 给予饮水,其他时段禁水让大鼠处于口渴状态。第8 天～第21 天进行空瓶应激,采用随机数字表每日早晚选取一个饮水时间段给予空瓶,另一时间段喂水。

1.3.1.2 心肌梗死模型 采用左冠状动脉前降支结扎构建心肌梗死大鼠模型。术前准备,调整小动物呼吸机参数,潮气量为每次0.8 mL,吸呼比为1∶2,通气频率为80 次/min。将大鼠称重后用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。备皮,消毒,固定大鼠,气管插管,连接小动物呼吸机。定位在大鼠胸骨旁左侧第3肋与第4 肋间,沿肋间方向切开皮肤,长约1.5 cm,逐层分离皮下组织、肌肉,撕开心包膜暴露心脏。用5.0缝合线,于心耳边缘下2 mm 处结扎左冠状动脉前降支,进针深度控制在1 mm、宽度1～2 mm,收线打结。术中肉眼可见结扎线远端心肌变白,逐层关闭胸腔。后移除呼吸机,轻捏大鼠胸廓,辅助其恢复呼吸。术后腹腔注射0.2 mL 利多卡因防止心律失常,注射4×105U青霉素预防术后感染。术中及术后的大鼠苏醒前注意保暖。术后第2 天行心电图检查,导联Ⅰ、aVL、V1～V6中有6 个及以上导联出现病理性Q 波即为心肌梗死模型成功。假手术穿线后打松结,余步骤相同。

1.3.1.3 心肌梗死合并焦虑模型[11]在不确定空瓶刺激造模的第15 天对大鼠实行心肌梗死手术,术后继续予以7 d 的空瓶刺激,至第22 天造模完成。

1.3.2 分组方法 造模成功后对大鼠进行超声心动图检查及行为学试验,处死动物,取血、心脏。将造模成功后的大鼠根据随机数字法分为心肌梗死组8 只(存活6 只)、假手术组(6 只)及心肌梗死合并焦虑组8 只(存活6 只)。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 超声心动图检测 将大鼠称重后用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定,左前胸大面积备皮,取左心室短轴切面,探测M 型曲线,每只大鼠取3 个连续心动周期,取平均值。主要检测大鼠的左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室短轴缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)。

1.4.2 旷场试验(OFT) 采用体积为100 cm×100 cm×40 cm 的木制黑箱,底板画有25 个正方形格子,在安静、弱光的环境下进行。先让大鼠适应性活动5 min,再将大鼠放在箱底中央格,开始计时并摄像,观察6 min 内大鼠的活动情况。记录大鼠在敞箱内水平运动格子数、垂直运动次数以及中央停留区时间。

1.4.3 高架十字迷宫试验(EPM) 该试验装置由两条相对开臂(50 cm×10 cm)和相对闭臂(50 cm×10 cm×40 cm)组成,中央有一开阔区(10 cm×10 cm),十字迷宫离地面50 cm。先让大鼠自由活动5 min,再将大鼠面向开放臂放入,开始计时并录像,观察5 min 内大鼠在开臂和闭臂的活动情况,记录大鼠的开臂次数(OE)、开臂停留时间(OT)、闭臂次数(CE)和闭臂停留时间(CT),计算OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)的比值。

1.4.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血ANP含量 大鼠麻醉后,打开腹腔,拨开内脏暴露腹主动脉,用采血针进行腹主动脉采血并置于普通采血管中,室温静置2 h,3 000 r/min 离心15 min,取上清液进行检测,根据ELISA 试剂盒说明书步骤进行指标检测。

1.4.5 免疫印迹法(Western Blotting)检测大鼠心房ANP 及NPRA 表达情况 经腹主动脉采血后,摘取心房组织,迅速投于液氮罐中低温保存。将心房组织充分裂解,加入配制好比例的AB 混合液,避光孵育,用DG-3022A 酶标仪测定OD568,根据标准蛋白浓度和相应的OD 值计算样品蛋白浓度。将提取的蛋白上清液与5×蛋白上样缓冲液沸水浴10 min,变性完后冷却至室温再放入-20 ℃保存。将制备好的胶固定到电泳槽上,储液池中倒入电泳液。用微量加样器将制备好的蛋白样品和Marker 加入上样孔,加样后进行电泳1.5 h。取出凝胶根据Marker 切下目的条带,剪出与PAGE 凝胶相同大小的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和滤纸,PVDF 膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。依次放好,夹紧板后放入转膜仪内开始转膜,封闭2 h。用封闭液稀释相应的一抗,使PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育过夜。用TBST 稀释相应的HRP 标记二抗(1∶50 000 稀释),浸泡于二抗孵育液中孵育2 h。洗去多余二抗,将ECL试剂按比例混匀,滴加工作液于PVDF 膜上反应,X 光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影,冲洗胶片。晾干胶片并扫描,用BandSca 分析胶片灰度值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计分析软件进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示,将多组独立样本进行正态性检验和方差齐性检验,如方差齐则采用单因素方差分析,必要时采用LSD 检验,方差不齐则采用独立样本秩和检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3 组大鼠超声心动图指标比较 与假手术组相比,心肌梗死组及心肌梗死合并焦虑组LVEF 及FS 明显下降(P＜0.01),LVESD 和LVEDD 明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.01);与心肌梗死组相比,心肌梗死合并焦虑组左室LVEF 及FS 有所下降,LVESD 和LVEDD 有所增加,但差异均无统计学意义(P＞0.05),说明焦虑刺激能促进心肌梗死大鼠心功能恶化。详见图1～图4。

图1 3 组大鼠LVEF 比较

图2 3 组大鼠FS 比较

图3 3 组大鼠LVESD 比较

图4 3 组大鼠LVEDD 比较

2.2 3 组大鼠行为学指标比较 行为学指标包括旷场试验和高架十字迷宫试验。旷场试验结果显示,与假手术组相比,心肌梗死合并焦虑组水平运动格子数及垂直运动次数明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05);与假手术组相比,心肌梗死组垂直运动次数明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05)。高架十字迷宫结果显示,与假手术组相比,心肌梗死组与心肌梗死合并焦虑组更倾向于待在闭臂里,OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),说明心肌梗死大鼠有一定的焦虑倾向。详见图5～图8。

图5 3 组大鼠水平运动格子数比较

图6 3 组大鼠垂直运动次数比较

图7 3 组大鼠OE/(OE+CE)比较

图8 3 组大鼠OT/(OT+CT)比较

2.3 3 组大鼠外周血ANP 水平比较 与假手术组相比,心肌梗死组及心肌梗死合并焦虑组大鼠外周血ANP 水平均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。详见图9。

图9 3 组大鼠外周血ANP 水平比较

2.4 各组大鼠心房ANP 及NPRA 表达情况 心房ANP、NPRA 及内参GAPDH 蛋白特异性条带见图10A,条带经BandScan 分析胶片灰度值,其表达含量统计结果见图10B、10C。与假手术组相比,心肌梗死组及心肌梗死合并焦虑组ANP 与NPRA 表达含量均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);与心肌梗死组比较,心肌梗死合并焦虑组ANP 与NPRA 表达含量均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨 论

本研究团队前期已成功建立心肌梗死合并焦虑模型,可用于心肌梗死合并焦虑疾病的研究[11]。该实验研究是在广泛性焦虑模型的基础上合并经典的冠状动脉左前降支结扎建立心肌梗死模型。通过行为学试验(高架十字迷宫和旷场试验)对焦虑行为进行评价,本研究结果证明了心肌梗死后大鼠也有一定的焦虑倾向。ANP 是肽类家族中最早发现的肽类蛋白,自1981年被发现后,大量研究已经证实其在人体中的生理功能[13]。利钠肽家族在心血管系统中发挥互补作用,ANP 具有利钠、利尿、血管舒张、抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抗肥大和脂解活性、减小心肌缺血面积,在调节血容量、血压和维持心脏结构与功能方面发挥重要作用[14-17]。有关体内、体外及临床研究证据显示,ANP 及相关通路是反映心脏代谢疾病的最佳指标[18]。在中枢系统方面,ANP 与焦虑、抑郁症、成瘾行为、创伤后应激障碍及其他压力相关疾病有密切联系[10,19-20]。有研究表明针刺的抗焦虑作用可能是通过调节ANP 及其受体实现的[21]。由于ANP 与心脏和心理均有内在联系,ANP 可能是心血管与心理疾病互为因果的潜在因素。

本实验结果显示,心肌梗死大鼠及心肌梗死合并焦虑大鼠血浆ANP 含量升高,与临床心肌梗死病人血浆ANP 升高结果一致,可能是心肌梗死后的一种应激反应。循环ANP 大部分由心房分泌,外周血ANP 升高,但该研究发现心肌梗死动物心房ANP 及其受体表达明显减少,与心肌梗死组相比,心肌梗死合并焦虑组心房ANP 及其受体表达升高,但心功能减退。证明心肌梗死动物合并焦虑刺激会进一步恶化心功能,使心房ANP 及其受体应激性增高。

综上所述,焦虑可进一步影响心肌梗死动物心功能指标,增加心肌梗死大鼠心房ANP 及其受体水平,使心房及外周ANP 应激性增高。本实验在心肌梗死亚急性期内进行的各项指标检测,为进一步探明焦虑对心肌梗死的影响,后期可从不同时间段动态观察心房及外周血ANP 浓度变化。