固相萃取/液相色谱-质谱/质谱法测定山银花中5种主要黄酮苷元的含量

史颖珠，侯建波，谢 文，姚滨滨，盛 涛，胡晓莉，张 辉

(1.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；2.杭州海关技术中心，浙江 杭州 310016；3.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016；4.浙江立德产品技术有限公司，浙江 杭州 310016)

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)、红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq,)、华南忍冬(LoniceraconfusaDC.)或黄褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或带初开的花，并在夏初花开放前采收获得。自《中国药典》2005年版起，与金银花进行区分。山银花具有清热解毒，疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热[1]。研究发现其还具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗动脉粥样硬化等作用[2-5]，在我国主要分布在长江以南的湖南、四川、广东、贵州、广西、云南等省区和长江以北的河南、山东、安徽和湖北等省份[6]。

山银花的有效成分除了绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙外，还有黄酮类、挥发油类、有机酸类和三萜类化合物[7-10]。有研究人员通过HPLC-MS/MS、光谱技术测定和鉴别山银花黄酮类、有机酸类和环烯醚萜类化合物的含量[11-13]，以及开展包含黄酮类化合物在内的指纹图谱研究[14-16]。由于黄酮类化合物种类较多，在植物体内苷元可与糖类物质形成不同的苷而普遍存在[17-19]，且标准品较难获取，目前除液相色谱-高分辨质谱法[20-22]，其他分析手段较难获得更全面的信息。本文通过文献调研筛选出山银花中5种主要黄酮苷元及其对应的黄酮苷(槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素、黄芩素、芦丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆树苷和黄芩苷)(化学结构式如图1所示)，通过盐酸水解，乙醇溶液提取，HLB固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱法对苷元进行定量测定，从而建立了山银花中槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黄芩素5种主要黄酮苷元含量的测定方法。该方法通过对黄酮苷元的检测，可更为全面地反映出各苷元所代表的黄酮类化合物总量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

API 4000型三重四极杆串联质谱仪(配电喷雾离子源ESI，美国AB公司)，1100型液相色谱仪(美国Agilent 公司)，Milli-Q Synergy 185超纯水器(美国Millipore公司)，IKA MS3 Basic型涡旋器(德国IKA公司)，24孔固相萃取装置(美国Supelco公司)，Heraeus Multifuge X1R型台式离心机(美国Thermo 公司)，G&G JJ500型电子天平(中国双杰公司)，Mettler AE260(瑞士Mettler Toledo公司)。

甲醇(色谱纯，Tedia公司)、甲酸(质谱级，Scharlau公司)、乙腈(色谱纯，Scharlau公司)、乙醇(分析纯，华东医药股份有限公司)、盐酸(优级醇，永华化学科技(江苏)有限公司)、叔丁基对苯二酚(TBHQ，分析纯，Aladdin公司)、L-(+)-抗坏血酸(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；CNW C18固相萃取柱(6 mL，500 mg，Anpel公司)，Waters C18固相萃取柱(6 mL，500 mg，Waters公司)，Waters HLB固相萃取柱(6 mL，200 mg，Waters公司)，Biocomma HLB固相萃取柱(6 mL，200 mg，Biocomma公司)；色谱柱：Mightysil RP-18(3 μm，4.6 mm×150 mm，日本关东化学株式会社)和 Inertsil ODS-3(3 μm，4.6 mm×150 mm，日本岛津公司)。

标准物质：槲皮素(纯度96.4%，ChromaDex公司)，木犀草素(纯度96.9%，ChromaDex公司)，山萘酚(纯度95.5%，中国食品药品检定研究院)，芹菜素(纯度98.5%，Bepure公司)，黄芩素(纯度99.2%，ANPEL公司)，芦丁(纯度95.0%，TRC公司)，木犀草苷(纯度98.9%，ANPEL公司)，紫云英苷(纯度99.1%，ANPEL公司)，野漆树苷(纯度98.9%，ANPEL公司)，黄芩苷(纯度96.8%，ChromaDex公司)。用甲醇将各化合物标准品溶解，稀释并定容获得10 mg/mL的标准储备液，根据需要用甲醇将储备液稀释至所需浓度。

图1 5种主要黄酮苷元及其对应黄酮苷的化学结构式

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：Mightysil RP-18(3 μm，4.6 mm×150 mm)，流动相：甲醇(A)-0.15%甲酸溶液(B)，梯度洗脱程序：0～10.0 min，40%～75%A；10.0～15.0 min，75%～90%A；15.0～22.0 min，90%A；22.0～23.0 min，90%～40%A；23.0～30.0 min,40%A；流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL；柱温25 ℃。

1.2.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：负离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：-4 500 V；雾化气压力(GS1)：289 kPa(42 psi)；气帘气压力(GS2)：310 kPa(45 psi)；辅助气流速(CUR)：172 kPa(25 psi)；离子源温度(TEM)：540 ℃；其它质谱参数如表1所示。

1.3 实验方法

称取0.5 g(精确至0.01 g)试样置于150 mL圆底烧瓶中，加0.5 g TBHQ，36 mL 50%的乙醇溶液和4.0 mL浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120 min，氮气保护下冷却后，加水定容至50 mL，取上清液1 mL，加入9 mL水，混匀并转移至HLB固相萃取柱中(依次用5 mL甲醇和5 mL 5%甲醇溶液活化)，加入5 mL 10%甲醇溶液淋洗，抽干后，加10 mL甲醇进行洗脱，控制流速为1～2 mL/min，收集全部洗脱液，甲醇定容至10 mL，摇匀，过0.22 μm有机滤膜，取1.0 mL定容溶液，加40%甲醇溶液稀释定容至25 mL，混合均匀，供LC-MS/MS测定。

表1 各化合物的基本信息及质谱测定条件

2 结果与讨论

2.1 水解与提取条件的选择

浸提、超声、回流等技术通常用于中草药中有效成分的提取，参考中国药典[1]的方法，实验首先采用超声方式进行提取，结果表明超声环境下黄酮苷几乎不发生水解反应。

对芦丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆树苷和黄芩苷在不同含量乙醇溶液(30%、50%、70%)，盐酸(5%、10%和12.5%)条件下，于氮气保护下水浴加热回流不同时间(30、60、90、120、180 min)进行实验，同时对比TBHQ和抗坏血酸两种不同抗氧化剂的保护情况。结果表明，在无抗氧化剂时，槲皮素、山萘酚和黄岑素的回收率低于50%。在抗坏血酸存在下，槲皮素、山萘酚和黄岑素的回收率无明显提高，而加入TBHQ后，槲皮素、山萘酚、黄岑素的回收率可达70%以上。乙醇溶液的含量变化对结果无明显影响，考虑到黄酮苷和苷元的溶解性差异，实验选择50%的乙醇进行实验。在50%乙醇溶液中，当盐酸浓度低于10%和水解时间小于120 min时，约20%的黄岑苷未水解。实验最终确定的水解与提取条件为：采用10%盐酸和50%乙醇溶液，在TBHQ和氮气保护下水解120 min。在上述条件下对10 ng/mL黄酮苷元进行实验，发现水解过程中各苷元的损失率均低于20%，有效保障了黄酮苷元的回收率。

图2 不同固相萃取柱的净化情况

2.2 净化条件的选择

考察了C18和HLB两种类型固相萃取净化柱对水解提取溶液的净化情况，以降低基质效应对LC-MS/MS定量测定的背景干扰，提高检测结果的准确性。实验取1 mL 100 ng/mL的黄酮苷元标准溶液(50%乙醇溶液，含10%盐酸和0.5 g TBHQ)，加入9 mL水，混匀并转移至各固相萃取柱中，分别采取10 mL的10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液淋洗和甲醇洗脱。结果如图2所示，50%甲醇溶液淋洗时，C18和HLB固相萃取柱中槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黄芩素均可以较好地被保留，甲醇洗脱回收率均大于65%，其中槲皮素和黄芩素在C18柱的净化回收率比HLB柱的净化回收率低5%～15%。Waters和Biocomma的HLB回收率无明显差异，但由于黄芪素采用Waters HLB的净化结果较好，且试验中Waters HLB的稳定性更好。因此，实验最终采用Waters HLB固相萃取柱开展方法学考察。

2.3 色谱条件的考察

对比了Mightysil RP-18(3 μm，4.6 mm×150 mm)和 Inertsil ODS-3(3 μm，4.6 mm×150 mm)两种色谱柱以甲醇或乙腈为有机相，0.15%甲酸溶液或水为水相时对目标化合物槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黄芩素5种黄酮苷元，及其对应的黄酮苷物质芦丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆树苷和黄芩苷(质量浓度均为2 ng/mL)的分离情况。

研究表明，相同色谱条件下，黄芩苷在Mightysil RP-18柱中分离时谱峰峰形更好，且信号提升约4倍。在相同色谱柱和梯度洗脱程序下，甲醇为有机相时大部分化合物的响应信号和峰形优于乙腈(其中野漆树苷、芦丁、木犀草苷在甲醇为流动相时响应信号提升3～5倍)。在相同色谱柱下，以甲醇为有机相，对比了水和0.15%甲酸溶液为水相的分离情况，以Mightysil RP-18色谱柱为例，在0.15%甲酸溶液中信号的峰形和响应优于水(其中黄芩素提升约5倍)。

因此，实验最终采用Mightysil RP-18为分离柱，甲醇为有机相，0.15%甲酸溶液为流动相。在该色谱条件下，分子离子峰相同的木犀草素和山萘酚，芹菜素和黄芩素，木犀草苷和紫云英苷可得到很好地分离(如图3)。

图3 液相色谱-质谱/质谱法对目标物(2 ng/mL)的分离结果

2.4 质谱条件的优化

对各黄酮苷和苷元的标准溶液分别进行稀释，采用流动注射的方式在负离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子峰，再分别以待测化合物的分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描。按照欧盟EC/657指令和《质谱分析方法通则》的要求，选择两个特征子离子对目标化合物进行定量确证，以其中信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。以多反应监测负离子模式优化各种质谱参数，获得的最佳质谱条件见表1。

2.5 基质效应的考察

通过对比相同浓度的溶剂工作液(稀释溶剂为流动相初始比例：甲醇-0.15%甲酸溶液，体积比4∶6)和经过前处理的基质加标溶液中各化合物的信号响应强度，计算离子抑制率[离子抑制率(%)=(溶剂工作液中响应强度-基质加标溶液响应强度)×100%/溶剂工作液中响应强度]以考察基质效应情况[23]。如表2所示，实验条件下，配制质量浓度为4 ng/mL的溶剂工作液和基质加标溶液，得到各化合物定量离子对的离子抑制率均小于15%，即该条件下获得的基质溶液无明显基质效应。因此采用甲醇-0.15%甲酸溶液(体积比4∶6)配制工作溶液进行定量计算。

2.6 线性关系、定量下限及回收率

在优化实验条件下，以待测物标准品的峰面积Y为纵坐标，以其含量X(g/kg)为横坐标，考察了5种黄酮苷元含量分别为0、0.05、0.1、0.5、1 g/kg(采用40%甲醇溶液配制)时的线性关系。结果显示，各化合物的线性范围均为0～1.0 g/kg，相关系数(r2)大于0.995。方法的定量下限(以S/N=10计)为0.005 g/kg(槲皮素)，0.01 g/kg(木犀草素和芹菜素)和0.05 g/kg(山萘酚和黄芩素)。

表2 山银花基质中各化合物的基质效应情况

在优化实验条件下，对山银花样品进行检测，测定样品水解后含槲皮素0.17 g/kg、木犀草素0.19 g/kg、山萘酚0.06 g/kg、芹菜素0.05 g/kg和黄芩素0.09 g/kg。对样品进行3个浓度水平的加标回收实验，加入各黄酮苷(添加量相当于水解后槲皮素和木犀草素含量分别为0.10、0.20、0.40 g/kg，山萘酚、芹菜素和黄芩素含量分别为0.05、0.10、0.20 g/kg)，每个含量水平取6个平行样，采用外标法定量。结果如表3所示，方法的平均回收率为70.4%～104%，相对标准偏差(RSD)为4.0%～12%。

表3 山银花中5种黄酮苷元在3个加标水平下的回收率及相对标准偏差(n=6)

2.7 实际样品的检测

应用本方法对采购的13批山银花样品进行测定，结果如表4所示。在山银花样品中检出的5种黄酮苷元中，木犀草素含量最高(0.112～0.453 g/kg)，其次是槲皮素(0.030～0.260 g/kg)和芹菜素(0.010～0.050 g/kg)，山萘酚和黄岑素的含量最低。

表4 山银花样品中的检测结果

3 结 论

本文通过含有盐酸的乙醇溶液水解山银花中5种主要黄酮苷，并对其黄酮苷元进行提取，HLB固相萃取柱净化，LC-MS/MS法检测，外标法定量，实现了对山银花中代表性黄酮苷(芦丁、木犀草苷、紫云英苷、野漆树苷和黄芩苷)的有效水解，及水解产物槲皮素、木犀草素、山萘酚、芹菜素和黄芩素含量的测定。该方法通过水解获得山银花中的黄酮苷元，并对其含量进行测定，可更准确地获得山银花中各主要黄酮类化合物含量的数据，对后续的含量分析以及药物活性关系和品质研究，具有重要的辅助作用。