“鲁保一号”菌株的鉴定和生防增效助剂筛选

李健，高兴祥，李美，房锋

(山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100)

菟丝子是菟丝子属(Cuscutasp.)植物的通称，能够通过吸器汲取寄主的养分，是一类危害严重的恶性寄生性杂草。菟丝子广泛分布于我国黑龙江、甘肃、山东、江苏、湖南、湖北、江西、广东等多个省份，对多种作物、牧草、中草药和观赏植物的生长构成严重威胁[1-3]。菟丝子生活力极强，且易与寄主产生紧密的寄生关系，化学除草剂不仅很难从根本上防除菟丝子，还易对宿主植物造成药害，且缺乏能够高效控制菟丝子的化学药剂。目前我国对环境友好型生物农药的研发越发关注，市场上对其生物防治的需求较高[4]。

“鲁保一号”[5]是山东省农业科学院刘志海等人于1963年研制成功的一种对菟丝子有特殊防效的微生物菌剂[6-8]。20世纪60年代中、后期，曾在山东、江苏、安徽、宁夏等20多个省区开展了“鲁保一号”菌剂的生产和应用，对控制菟丝子的蔓延和危害起到一定作用[8]。虽然“鲁保一号”菌株具有较高的应用价值和经济价值，但由于其应用较早，对其防控效果和致病力方式描述较少。

农药助剂(pesticide adjuvant)是指能够改善农药性能、增强农药应用效果的一类在农药田间应用过程中除农药原药成分之外的其他辅助物[9,10]。目前微生物农药助剂应用较为广泛多样，对相关生物农药剂型的改进和防效的增强具有重要作用[11-13]。但在生物农药助剂应用过程中，要防止助剂对微生物活性的影响，因此筛选与相应微生物具有相容性的助剂至关重要[14]。本试验对“鲁保一号”菌株进行重鉴定，研究其对菟丝子的防控效果和对多种作物的安全性，并筛选出合适的增效助剂，为其深入开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株“鲁保一号”保存于山东省农业科学院植物保护研究所。供试宿主为菟丝子；安全性检测作物为大豆、玉米、小麦、水稻、柑橘、苹果、梨树、冬青、黑麦草。

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

病原菌分子水平鉴定所需试剂购自日本TaKaRa公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。

本试验用相关助剂由本实验室保存或购自相应农药公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分子鉴定 采用PDA培养基活化并扩大培养“鲁保一号”菌株，提取其基因组 DNA[14]，应用表1引物分别扩增28S rRNA 基因LSU(GenBank：MT458694)和甘油醛三磷酸脱氢酶基因GAPDH(GenBank：MT459804)的序列。反应体系(20 μL)：10 × buffer 2 μL，dNTP 1 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，酶 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。PCR 反应条件为: 94℃ 4 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，29个循环；72℃ 10 min。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，BLAST 比对分析，并用MEGA 6.0软件构建系统发育树对该菌进行鉴定。

表1 本试验所用引物序列

1.2.2 致病力和安全性测定 PDA培养基活化“鲁保一号”菌株，7 d后，用0.1%吐温80配置浓度为1×106个/mL的分生孢子液，按照每666.7m245 L用量均匀喷洒于菟丝子和安全性检测作物表面。3 d后观察侵染位置，7 d和14 d后观察并记录安全性检测效果。

1.2.3 农药助剂对孢子萌发的影响 PDA培养基活化“鲁保一号”菌株。根据不同助剂田间使用倍数，配制含有相应助剂的浓度为1×106个/mL的孢子液，25℃黑暗培养，24 h后记录分生孢子萌发数。

孢子萌发率(%)=处理组萌发数/对照组萌发数×100。

1.2.4 农药助剂对防效的影响 PDA培养基活化“鲁保一号”菌株。根据不同助剂田间使用倍数，配制含有相应助剂的浓度为1×106个/mL的孢子液，按照每666.7m245 L用量均匀喷洒于菟丝子上。3 d后计算感病率，即每2 cm菟丝子茎上的病斑率。14 d后统计鲜重防效：随机挑选防治组和对照组相同长度(各3条，每条15～20 cm)的菟丝子，每个处理重复3次。

鲜重防效(%)=(对照平均鲜重-处理平均鲜重)/对照平均鲜重×100。

1.3 数据处理与分析

利用SPSS统计软件分析不同处理间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 “鲁保一号”菌株鉴定

基于LSU和GAPDH基因的进化树(图1)显示，该菌与尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)进化关系最近，从分子生物学水平上将该菌株进一步鉴定为尖孢炭疽菌菟丝子专化型(C.acutatumsp.cuscuta)。

A:LSU基因遗传进化分析; B:GAPDH基因遗传进化分析;Colletotrichumpyricola: 梨炭疽菌;Colletotrichumfioriniae: 油茶炭疽菌;Colletotrichumkniphofiae:刀状炭疽菌;Colletotrichumorchidophilum: 兰花炭疽菌:Colletotrichumhigginsianum: 希金斯炭疽菌;Colletotrichumaotearoa: 奥特阿罗刺盘孢菌;Colletotrichumgloeosporioides: 胶孢炭疽菌;Colletotrichumsiamense: 橡胶树炭疽菌;Colletotrichumacutatum: 尖孢炭疽菌;Colletotrichumvietnamense: 兜兰炭疽菌;Colletotrichumdematium: 束状刺盘孢;Colletotrichumtruncatum: 大豆炭疽病菌;Colletotrichumbrevisporum: 百香果炭疽菌;Monilochaetesguadalcanalensis:瓜达卡纳尔瓶梗附孢。

图1“鲁保一号”菌株的系统发育进化树

2.2 致病力和安全性分析

接菌3 d后，“鲁保一号”菌株即可完成对菟丝子的侵染，导致侵染部位呈褐色并逐渐干枯，接菌14 d后，多数菟丝子枯死(图1A)，鲜重防效可达67.6%。“鲁保一号”菌株可以通过菟丝子茎表面完成侵染过程，并形成近椭圆形病斑，病斑边缘呈深褐色(图2B)；该菌能够通过菟丝子侵染过程中形成的吸器入侵菟丝子，导致菟丝子吸器部位黑化(图2C)。多种植物的安全性试验显示，“鲁保一号”对大豆、玉米、小麦、水稻、梨树、冬青和黑麦草安全；接菌3 d后柑橘、苹果叶片虽产生暗黑色小斑点，但是后期未扩展，未造成叶片病死，总体安全。

2.3 不同助剂对孢子萌发和防效的影响

本试验研究了目前田间常用的12种助剂，既包括常规化学农药助剂，也包含微生物农药专用助剂。孢子萌发试验显示，常规田间推荐使用浓度下，多数助剂不影响孢子的萌发，仅两种助剂(省功宝和G-1801)对孢子的萌发产生显著影响(表2)。

A：接菌14 d后致病效果观察；B：茎侵染病斑；C：吸器侵染。

防效试验显示，有机改性硅聚醚和Silwet 408对其防效有一定的增进作用，其它助剂无效或会影响该菌株的防效(表2)。

表2 助剂对孢子萌发和防效的影响

3 讨论与结论

“鲁保一号”菌株是我国第一个大规模应用的生物除草剂，在我国乃至世界范围内的生物除草剂研究过程中具有举足轻重的地位，但是因其应用年代较为久远，对于其致病方式、防控效果的评价缺乏直观图文描述[1-3]。早期将“鲁保一号”菌株鉴定为胶孢炭疽菌[15]，但缺乏对于其形态描述和分子生物学鉴定的相关数据。本试验克隆了广泛应用于真菌分类的相关基因LSU和GAPDH[16,17]，结合早期克隆的ITS序列[5]，通过分析进一步将该菌株确定为尖孢炭疽菌菟丝子专化型(C.acutatumsp.cuscuta)。

本研究首次报道了“鲁保一号”菌株初侵染部位和防控效果，结果显示该菌株防控菟丝子效果显著。近些年，菟丝子危害越发严重[18]，“鲁保一号”菌株能够通过菟丝子吸器部位直接侵入内部，从根源处杀死菟丝子，且不造成宿主作物的药害发生，说明该菌具有广泛的应用价值。筛选高性能的“鲁保一号”菌可用助剂对于其进一步应用具有重要作用。良好的助剂不仅能增强生防菌的致病力，而且有助于保护生防菌的稳定性，从而促进生物农药的高效应用[19]。本试验明确了少数助剂可能抑制孢子的萌发，因此初步筛选至关重要，进一步的防效筛选得到两种增效助剂，对于“鲁保一号”菌株的生产应用具有指导作用。目前，我国对于环境友好型生物除草剂的需求越来越高，本研究表明该菌株具备再开发利用的潜力。