马疱疹病毒1 型X J2015 株的增殖、纯化及鉴定

贾钦瑞，鲍子磊，车传忠，郑学功，翟少华，冉多良

新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052

马疱疹病毒1 型（equine herpesvirus-1，EHV-1）是马属动物传染性疾病重要病原之一，该病在全世界广泛分布，患病马主要临床症状为呼吸系统疾病、孕马流产、新生马驹死亡和中枢神经系统（CNS）疾病，给养马业造成严重的经济损失［1-4］。

目前该病防治措施主要以疫苗免疫为主，获得高纯度、高回收率、稳定性较好的病毒能减轻免疫后副反应，是提高疫苗质量及安全的重要手段［5］。国内还未研制EHV-1 商品化疫苗，纯化工艺尚需补充。本研究采用蔗糖密度梯度超速离心法纯化EHV-1病毒颗粒，通过免疫电镜观察、病毒效价、SDS-PAGE、Western blot、马致病性试验方法，对纯化方法的可行性进行分析，以期用于抗体制备、筛选及抗原检测等相关研究，为该病毒的疫苗研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒及细胞 EHV-1-XJ2015 分离株、RK-13 细胞由新疆农业大学传染病实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 EHV-1 标准阳性血清由美国俄亥俄州动物疫病诊断实验室（ALADS）惠赠；高糖培养基（DMEM）、双抗购自美国Hyclone 公司；胎牛血清购自以色列BI 公司；胰酶、EDTA 购自北京索莱宝科技有限公司；硫酸铵、蔗糖、透析膜购自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 蛋白定量分析试剂盒购自美国Thermo 公司；HRP 标记的山羊抗马IgG 购自美国Abcam 公司；PVDF 膜购自美国Millipore 公司。

1.3 实验动物 母马，2～3 岁，购自伊犁尼勒克马场，通过间接ELISA 方法［6］筛选EHV-1 抗体阴性马匹。

1.4 细胞培养及病毒增殖 RK-13 细胞长成致密单层时更换为含1% FBS 的DMEM 培养基，将EHV-1-XJ2015 按MOI = 0.1 接种细胞，37 ℃，5% CO2培养箱培养至CPE 达90%以上时，收获病毒液。

1.5 病毒浓缩及纯化

1.5.1 浓缩 将病毒原液与pH 7.0 的60%饱和硫酸铵溶液混合，4 ℃搅拌过夜后静置2 h；4 ℃，7 500 ×g离心60 min，弃上清，PBS 重悬沉淀并转移至截留相对分子质量100 kD 的透析袋中，4 ℃透析48 h。

1.5.2 纯化 用PBS 配制10%、30%及60%的蔗糖密度梯度溶液，沿离心管侧壁缓慢从高浓度至低浓度依次加入1 mL，取1 mL 浓缩病毒液加至梯度柱顶部，4 ℃，110 000×g离心2 h，收集纯化病毒液，4 ℃，110 000 ×g离心2.5 h 进行脱糖，预冷PBS 重悬病毒，置-70 ℃保存备用。

1.6 免疫电镜观察 采用液相免疫电镜法-离心法。取待检样品（0.2 mL）与阳性血清（0.1 mL）充分混合，37 ℃感作1 h；10 000 ×g离心30 min，弃上清，PBS 重悬沉淀，于铜网吸附5 min，滤纸吸取多余病毒悬液，滴加20 g ／ L 磷钨酸进行负染，待铜网干燥后电镜观察。

1.7 病毒滴度检测 采用Reed-Meunch 法检测病毒原液、浓缩病毒液及纯化病毒液病毒滴度，按下式计算病毒回收率。

1.8 纯化抗原的鉴定 取RK-13 细胞上清液、病毒原液、浓缩病毒液及纯化病毒液，进行SDS-PAGE 分析及Western blot 鉴定。

1.8.1 SDS-PAGE 将样品煮沸变性后，于12%SDSPAGE，80 V 电泳40 min，待样品进入分离胶后，120 V 继续电泳90 min；考马斯亮蓝染色24 h 后脱色、照相。

1.8.2 Western blot 将样品经12% SDS-PAGE 分离蛋白后，转印至PVDF 膜，用5%脱脂乳4 ℃封闭过夜；加入标准阳性血清（5%脱脂奶粉1 ∶200 稀释），37 ℃孵育2 h；PBST 洗涤3 次，5 min ／ 次，加入HRP 标记的山羊抗马IgG（5%脱脂奶粉1 ∶10 000稀释），37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤5 次，5 min ／ 次，DAB 显色，照相。

1.9 马体致病性试验 用PBS 将纯化病毒液稀释至106TCID50／mL，鼻内感染（超声雾化器）马，1 mL／匹，攻毒后观察14 d，设攻毒组和PBS 对照组，每组2匹（分别编号为1 ～ 4 号），每日监测体温变化，并采用gB 荧光定量PCR 法检测鼻液排毒情况。上游引物：5′-TCTTTAGCGGTGATGTGGAA-3′，下游引物：5′-AGGTCGTAGGTGCGGTTAGA-3′，扩增片段大小130 bp。反应体系：模板2.00 μL，上下游引物各1 μL，2 × PCR Master Mix 25 μL，Rnase free d H2O 21 μL。反应条件：96 ℃预变性2 min；96 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸10 s，共40 个循环。

2 结 果

2.1 病毒增殖情况 RK-13 细胞接种EHV-1-XJ2015后产生CPE，细胞圆缩、聚团并形成合胞体，见图1。

图1 RK-13 细胞CPE 观察（× 100）Fig.1 CPE of RK-13 cells（× 100）

2.2 病毒纯化及电镜观察 结果显示，pH 7.0 的60%饱和硫酸铵溶液将1 L 病毒液浓缩至50 mL（PBS 4 ℃透析48 h），经蔗糖密度梯度离心后，形成3 个清晰条带，见图2；电镜下观察可见球形、有囊膜，直径约120 nm 的病毒粒子，见图3。

2.3 病毒滴度 病毒原液（1 000 mL，病毒滴度1 ×108.23TCID50／ 0.1 mL）经蔗糖密度梯度离心纯化后，滴度可达1×1010.02TCID50／0.1 mL，回收率为61.7%。

2.4 纯化抗原的鉴定 SDS-PAGE 分析显示，各样品在相对分子质量约65 000 处均可见杂蛋白条带，可能为血清白蛋白，经纯化后，杂蛋白明显减少；Western blot 分析显示，浓缩、纯化病毒液在相对分子质量25 000 ～ 150 000 之间的蛋白条带能被马多抗血清特异性识别，具有较好的反应原性。见图4。

图2 EHV-1 蔗糖密度梯度离心Fig.2 Sucrose density gradient centrifugation of EHV-1

图3 EHV-1 的电镜观察（× 60 000）Fig.3 Electron microscopy of EHV-1（× 60 000）

图4 纯化抗原的SDS-PAGE（A）及Western blot 分析（B）Fig.4 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of purified antigen

2.5 马体致病性 PBS 对照组马匹体温正常，无排毒现象。病毒经呼吸道感染马后，均出现EHV-1 原发性感染的临床症状，包括发热、食欲不振、浆液性鼻液和下颌淋巴结肿大；感染第2 天出现不同程度发热，体温超过39 ℃，发热持续了3 ～ 7 d，1 号马体温最高可达40 ℃，2 号马体温可达39.2 ℃。见图5。荧光定量PCR 结果显示，1 和2 号马匹均出现排毒现象，见图6。

图5 病毒感染马的体温变化Fig.5 Body temperature of horses infected with EHV-1

图6 病毒感染马的呼吸道排毒情况Fig.6 Virus shedding in respiratory tract of infected horses

3 讨 论

目前尚无治疗EHV-1 的特效药，常用商品化灭活疫苗及减毒活疫苗进行预防，我国尚未研制出相关疫苗，预防用疫苗依赖于进口。病毒纯化是动物病毒学研究的重要前提，在病毒微观结构研究、致病性研究、诊断抗原制备、新疫苗研制及病毒基因组测序等领域，均需要制备高纯度的病毒粒子［7-8］。疱疹病毒难以纯化，在纯化过程中易导致病毒感染性丧失或不能有效分离细胞相关物质，但随着纯化工艺的不断改进，病毒纯化已成为可能。其中密度梯度离心纯化病毒方法简单，操作易于掌握，可获得完整病毒颗粒并保持病毒的感染性，病毒层条带清晰利于回收，该技术常用于病毒免疫原性分析及全基因组功能方面研究［9-12］。

本研究采用60%饱和硫酸铵沉淀法及蔗糖密度梯度离心进一步纯化EHV-1 后，病毒滴度显著上升，可达1010.02TCID50／0.1 mL，病毒得率为61.7%；透射电镜观察病毒相对完整，直径在100 ～ 200 nm 之间；纯化病毒经SDS-PAGE 分析，可见杂蛋白明显减少，Western blot 分析，显示出较好的反应原性；动物致病性试验中，感染马出现原发性感染的临床症状，包括发热、食欲不振、浆液性鼻液和下颌淋巴结病肿大；荧光定量PCR 结果显示，感染马可长期通过呼吸道排毒，与之前报道的攻毒试验结果相符［13］。本文为进一步研究EHV-1 的致病机理以及减毒、灭活疫苗的研发提供了参考。