ABCB1基因多态性与河南中部汉族膜性肾病患者个体化使用他克莫司的相关性研究

徐炳欣，许宏磊，王申伟，沈志伟，赵 艳，王 琼

(1.河南科技大学附属许昌市中心医院 a.药学部，b.肾内科，河南 许昌 461000；2.河南省许昌市分子医学重点实验室，河南 许昌 461000)

他克莫司是临床治疗膜性肾病(membranous nephropathy，MN)最常用的药物，但该药治疗窗窄且个体间药动学差异大[1]。当其浓度过低达不到治疗作用，浓度过高则又会引起药物相关的毒性反应，因此临床在应用他克莫司时常需要血药浓度监测来调整给药剂量[2]。血药浓度监测在他克莫司的个体化给药中占据重要位置，现阶段已是膜性肾病患者在疾病治疗中必需的检测手段。然而，血药浓度监测具有滞后性，且由于个体差异，患者往往需要重复多次采血监测和剂量调整才能达到目标浓度。因此，如何在患者用药前针对个体差异进行给药方案制定，是当前MN治疗中亟待解决的问题。现有研究[3，4]显示，他克莫司药物相关的基因组学信息可能对剂量调整提供指导，研究主要围绕CYP3 A5*3和多药耐药性蛋白(ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1)基因多态性展开。CYP3 A5*3基因多态性对他克莫司的影响，目前研究结论较为一致[5]；而ABCB1基因多态性对他克莫司的影响，当前研究尚存在争议，且多数研究均以移植术后患者作为研究对象，针对MN患者的研究目前尚且少见[6]。鉴此，本研究以河南中部汉族MN患者为研究对象，研究ABCB1基因多态性与MN患者应用他克莫司给药剂量(D)、稳态血药浓度/给药剂量比值(C0/D)的关系，以期为当地MN患者的个体化治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料应用前瞻性研究方法，将2016年2月至2019年10月在许昌市中心医院肾内科住院的102例MN患者为研究对象。纳入标准：①经病理检查确诊为MN；②治疗时间大于6个月；③患者为河南中部汉族。排除标准：①不能耐受激素及免疫抑制剂治疗者；②合并糖尿病者；③治疗期间不能规律用药或者临床资料不全者。本研究经许昌市中心医院伦理委员会审核批准。所有患者药物治疗方案为他克莫司联合激素常规治疗。其中他克莫司胶囊(商品名：普乐可复；生产厂家：Astellas Ireland Co.Ltd，注册证号：H20150197)初始给药方案为1粒/次，2次/天，早餐和晚餐前1个小时内给药，后根据血药浓度监测结果调整给药剂量。患者均给予泼尼松、五酯软胶囊、他汀类药物及抗血小板等药物治疗。30天为一个疗程，连续治疗6个疗程。

1.2 方法

1.2.1ABCB1基因多态性检测方法 采用荧光染色原位杂交技术检测受试者ABCB1基因多态性，受试者于入院后次日清晨用EDTAK2 抗凝的采血管取空腹静脉血2 ml，取全血100 μl置于900 μl稀释后的NH4Cl预处理液(购自北京华夏时代基因科技发展有限公司)中，涡旋震荡10 s，静置5 min后3000 rpm离心5 min，去除上清液留取下层白细胞备用。取耀金染试剂(购自北京华夏时代基因科技发展有限公司)30 μl加入白细胞中得到白细胞悬液。取白细胞悬液2 μl加入ABCB1基因(rs1128503、rs2032582、rs1045642)耀金分试剂(北京华夏时代基因科技发展有限公司)，置入Tl998 A 荧光检测仪(西安天隆科技有限公司生产)，其结果由Microseq软件分析和自动判读。

1.2.2他克莫司血药浓度检测方法 受试者按同一给药方案规律服药至少7天后于下一次给药前半小时抽取空腹静脉血，置于EDTAK2 抗凝的采血管中，采用均相酶免疫分析法测定他克莫司谷浓度。他克莫司检测试剂[国食药监械(进)字2009 第2400651 号]由西门子医学诊断产品(上海)有限公司提供。研究所收集的他克莫司谷浓度为受试者服药6个月时的稳态血药浓度，并通过电子病历系统收集患者的给药剂量[D，mg/(kg·d)]，并以血药浓度谷浓度(C0)计算C0/D[mg/(ml·d)]。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0统计软件进行数据处理。判定ABCB1(rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因各基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律采用χ2检验，计量数据(D和C0/D)不符合正态分布，以M(P25，P75)表示，三组间比较采用kruskal-Wallis检验，两两比较均经Bonferroni校正。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者一般资料纳入研究的102例受试者，男69例，女33例，年龄42～71岁[(56.38±12.51)岁]；合并疾病中，高血压17例(16.67%)，高脂血症21例(20.59%)，冠心病8例(7.84%)，有脑卒中史患者11例(10.78%)，甲状腺疾病15例(14.71%)，受试者他克莫司C0均值为(9.62±1.55)ng/ml，均在目标浓度5～15 ng/ml内。

2.2 ABCB1基因类型的Hardy-Weinberg遗传平衡102例受试者，ABCB1 (rs1128503)中野生基因型TT型30例、突变基因型CT型58例，纯合突变基因型CC型14例；ABCB1 (rs2032582)中野生基因型TT型29例、突变基因型GT型55例，纯合突变基因型GG型18例；ABCB1 (rs1045642)中野生基因型TT型21例、突变基因型CT型48例，纯合突变基因型CC型33例。ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因各基因型的实测值与理论值差异无显著性，符合Hardy-Weinberg 遗传平衡，说明本研究纳入的样本具有群体代表性，见表1。

表1 ABCB1基因类型的Hardy-Weinberg遗传平衡 [n(%)]

2.3 ABCB1基因类型间他克莫司的D和C0/D比较治疗6个月后，纳入研究受试者他克莫司C0均在5～15 ng/ml。ABCB1 (rs1128503)基因CC型患者的D高于CT型患者和TT型患者，C0/D低于CT型患者和TT型患者，差异均有统计学意义(P<0.05)；ABCB1 (rs2032582、rs1045642)各基因型之间D、C0/D差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。两两比较经Bonferroni校正，TT组他克莫司D、C0/D与CC组相比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

3 讨论

目前有关药物基因组学指导他克莫司个体化给药的研究，大多以心脏[7]、肝脏[8]、肾脏[9]等移植术后患者为研究对象，针对MN患者的研究文献报道有限。因此，本研究以河南中部汉族MN患者为研究对象，探讨影响他克莫司给药剂量、稳态血药浓度/给药剂量比值的遗传因素，为确定维持正常浓度范围所需的他克莫司口服剂量提供临床研究证据。

研究发现ABCB1基因有50多个单核苷酸多态性(SNPs)位点[10]，本研究中主要检测ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)三个SNPs位点，是因为文献报道[11]这三个位点发生突变对中国人群可能有影响。ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因在不同种族间的突变频率有较大差异，本研究中ABCB1 (rs1128503)基因突变比例为86.27%，ABCB1 (rs2032582) 基因突变比例为82.35%，ABCB1 (rs1045642) 因突变比例为37.65%，与既往报道[12，13]中的突变比例相一致。

本研究显示ABCB1(rs1128503、rs2032582、rs1045642) 三个SNPs位点中，只有ABCB1 (rs1128503)基因多态性对D、C0/D有影响，其中CC型患者的D高于CT型患者和TT型患者，C0/D低于CT型患者和TT型患者。这提示临床应用他克莫司治疗MN时，应关注患者ABCB1 (rs1128503)基因多态性，在维持同样药物浓度的前提下，TT型患者可能需要较低的他克莫司给药剂量。不同ABCB1 (rs1128503)基因类型之间的他克莫司D、C0/D有差异，考虑与ABCB1 (rs1128503)基因多态性影响他克莫司的体内转运过程有关。ABCB1 (rs1128503)基因位于7号染色体的12号外显子上，其编码的P-糖蛋白属于ATP 结合转运蛋白，在人体多个器官均有表达[14]。ABCB1 (rs1128503)基因发生突变会使P-糖蛋白的表达降低，进而影响药物从细胞内到细胞外的转运过程，导致细胞中的药物浓度增高[15]。当前ABCB1基因多态性与他克莫司个体化用药之间的关系尚存在争议。马多玲等[16]以肾移植受试者为研究对象，研究指出ABCB1 (rs1128503)基因多态性影响他克莫司的C0/D，同样结论在胡楠等[17]的研究中也得到验证，本研究结论与其基本保持一致。杜雯雯等[18]以肺移植术后患者为研究对象，研究指出ABCB1(rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因多态性均不影响他克莫司的D与C0/D。魏菁菁等[19]研究显示，ABCB1(rs1045642)基因多态性对C0/D有显著影响，本研究结论与其不一致。不同研究中的结论不一致，考虑与纳入受试者的疾病状态、数量、基因突变背景等因素相关。本研究纳入受试者较少，后续需要扩大样本量来得到更为准确的结论。

MN的治疗是一个较为长期的过程，在用药前明确不同基因类型患者用药后D、C0/D之间的差异，对于实现他克莫司的个体化给药并保障患者用药安全有效有重要的意义。近年来，随着药物基因组学相关技术的发展，更多预测药物疗效的检测手段应用于临床，为MN患者的临床治疗用药决策提供了切实可行的指导。本研究明确了ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因多态性对河南汉族MN患者应用他克莫司D、C0/D的影响，临床医师可根据患者的ABCB1 (rs1128503)基因型初步预测患者应用他克莫司的D、C0/D，据此做好医患沟通并制定个体化的用药方案，以确保疾病治疗的安全有效。

综上，ABCB1 (rs1128503)基因多态性与D、C0/D有关，检测ABCB1 (rs1128503)基因多态性可能对MN患者个体化使用他克莫司具有指导价值。但本研究是单中心研究，且研究纳入样本量较小，ABCB1 (rs1128503)基因CC型患者与CT型患者在样本量有较大差异，这些因素均会导致研究结论有所偏倚，因此本研究结论有待多中心、大样本量的研究予以证实。