芘与人血清白蛋白和牛血清白蛋白结合位点微环境极性的差异

李梦硕，张 静，刘 丹，朱亚先，张 勇

（1.近海海洋环境科学国家重点实验室(厦门大学),厦门大学环境与生态学院,厦门361000；2.河口生态安全与环境健康省重点实验室,厦门大学嘉庚学院,漳州363105；3.厦门大学化学化工学院化学系,厦门361005）

多环芳烃（PAHs）具有基因毒性、遗传毒性、发育毒性及“三致效应”等，会对人体健康造成潜在危害［1～3］.PAHs进入人体血液后，溶解态的PAHs被迅速代谢，而另一部分则结合血清白蛋白被运输至各个器官［4］.因此，研究PAHs与血清白蛋白的相互作用，对了解PAHs在人体内的吸收、代谢和毒性机制具有重要意义.然而，目前相关研究仍大量采用牛血清白蛋白（BSA）替代人血清白蛋白（HSA）作为模式蛋白［5～9］.研究表明［10］，HSA和BSA具有24%氨基酸序列的差异，其中BSA有2个色氨酸（Trp）残基Trp134和Trp213，而HSA只有1个色氨酸残基Trp214.Clara等［11］和Wani等［12］的研究表明，华法令、来那替尼和它莫西芬分别与HSA和BSA相互作用的结合猝灭常数有数量级的差异.此外，本课题组［13～15］利用荧光各向异性、同步荧光法、激发发射矩阵结合平行因子法（Excitation-emission matrix spectralparallel factor，EEM-PARAFAC）和分子动力学等方法研究了母环、烷基取代PAHs及其代谢产物与HSA或BSA的相互作用，发现HSA和BSA分别与不同甲基取代位置菲的作用存在差异.因此，进一步明确HSA及BSA与有机小分子污染物之间相互作用机制的差异十分必要.

本文采用稳态荧光光谱、荧光共振能量转移技术结合分子对接法，选择具有微环境极性探针性质的芘（Pyr）作为污染物有机小分子，分析比较了其分别与HSA和BSA相互作用时结合口袋微环境的极性变化、作用位点、作用距离等，揭示了Pyr与HSA和BSA相互作用的过程和机理间存在的差异.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

BSA（纯度＞96%）、Pyr（A.R.级）和三羟甲基氨基甲烷（A.R.级）均购于阿拉丁试剂（上海）有限公司；HSA（纯度＞96%）购自美国Sigma试剂公司；无水乙醇等其它药品（A.R.级）购自上海国药集团化学试剂有限公司.

QM 8000型荧光光谱仪（日本Horiba公司）；Agilent 8453型紫外-可见分光光度计（美国Agilent公司）；Five Easy Plus型台式pH计（美国Mettler Toledo公司）.

1.2 实验方法

1.2.1 荧光光谱和紫外吸收光谱测定 将0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液、1×10-6mol/L HSA和BSA及不同浓度的Pyr依次分别加入2组10 mL棕色比色管中，摇匀后静置30 min，待体系达到平衡后分别进行UV-Vis吸收光谱和荧光光谱测定.荧光光谱仪参数设定：激发和发射狭缝分别是3 nm和2 nm，延迟时间为0.05 s，步长为1 nm.分别测定激发波长为280 nm和295 nm时，Pyr-HSA和Pyr-BSA体系在300～450 nm范围内的发射光谱.

1.2.2 分子对接模拟 利用Auto Dock 4.2.1和Auto Dock Tools软件对Pyr与HSA和BSA分别进行分子对接，对接过程、参数均参考文献［16］方法.利用Pymol软件进行可视化研究，并计算最优构型结合口袋的Pyr周围0.4 nm范围内氨基酸的极性及其与色氨酸残基表观距离.

2 结果与讨论

2.1 Pyr与HSA和BSA结合位点疏水性的差异

研究［17～19］表明，PAHs与HSA和BSA的作用位点主要在ⅡA，ⅢA和IB子域，而不同结合位点微环境疏水性的对比研究鲜见报道.本文利用Pyr的373 nm/384 nm（I1/I3）微极性探针性质［20，21］，考察了Pyr与HSA和BSA结合口袋微环境的极性差异.血清白蛋白因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），在270～300 nm光激发下可发射较强的内源荧光.当激发波长为295 nm时，HSA中332 nm处的最大发射波长由Trp214贡献；而BSA中341 nm处的最大发射波长由Trp134和Trp213贡献.荧光光谱测定结果如图1所示，Pyr-HSA和Pyr-BSA体系中HSA和BSA的色氨酸残基荧光产生猝灭，表明Pyr与HSA和BSA的结合位点均靠近色氨酸残基.在Pyr-HSA体系中，结合态Pyr的I1/I3值随Pyr浓度的增加轻微下降（图2），说明其与HSA中的Trp214逐渐靠近.在Tris-HCl缓冲溶液中溶解态Pyr的I1/I3值为1.85，而与HSA和BSA相互作用后结合态Pyr的I1/I3值分别为1.36和0.92，可见结合态Pyr的I1/I3值均降低，且在BSA及HSA中结合位点微环境的极性具有差异.

Fig.1 Fluorescence spectra of HSA and BSA in the presence and absence of Pyr

Fig.2 Trend in the I1/I3 ratio as a function of increasing Pyr concentration(λex=295 nm)

2.2 Pyr与HSA和BSA结合平衡常数的差异

研究［22，23］表明，Pyr与HSA和BSA的结合作用力以疏水作用为主，利用荧光猝灭法测定了Pyr-HSA和Pyr-BSA的猝灭常数（Ksv）、猝灭速率常数（Kq）和结合常数（Kb）.如图3所示，随着Pyr浓度的增加，BSA在340 nm的荧光发射峰强度逐渐降低，HSA在334 nm的荧光发射峰强度逐渐降低，表明HSA和BSA均与Pyr发生相互作用导致其内源荧光发生猝灭［24］.利用Stern-Volmer方程［25］计算了Pyr对HSA和BSA的猝灭常数（Ksv）和猝灭速率常数（Kq）（图4），结果列于表1.可见，Pyr-HSA和Pyr-BSA体系的Kq均大于生物大分子在溶液中的最大动态猝灭常数1010mol-1·s-1，说明上述体系均以静态猝灭为主.作用体系的Kb值从Pyr-HSA的1.86×107L/mol降低到Pyr-BSA的1.71×105L/mol.

Fig.3 Fluorescence quenching spectra of HSA(A)and BSA(B)by Pyr at 298 K

Fig.4 Stern-Volmer(A)and double logarithmic(B)plots for the fluorescence quenching of HSA and BSA by Pyr

Table 1 Binding constants and number of binding sites of the Pyr-HSA/BSA systems(λex=280 nm)

2.3 Pyr与HSA和BSA作用距离的差异

为进一步明确Pyr与HSA和BSA结合位点是否存在差异，需明确结合在HSA和BSA中的Pyr与色氨酸残基的作用距离.能量转移效率（E）和结合距离（rDA）可用于探讨Pyr与HSA和BSA作用距离的差异.如图5所示，受体Pyr满足同供体HSA和BSA中色氨酸残基发生能量转移的要求.根据Först’s非辐射能量转移理论［26，27］，采用FelixGX 4.1.2软件计算了Pyr分别与HSA和BSA之间的E和rDA.结果显示，体系中结合态Pyr与HSA和BSA中色氨酸残基的表观距离（R0）分别为2.37和2.34 nm，与文献［22，23］报道结果在同一数量级.如表2所示，当体系中Pyr与HSA和BSA的浓度比为1∶1时，Pyr与HSA的E值略高于BSA.与上文Pyr-HSA和Pyr-BSA体系的Kq值相比可知，结合态Pyr与HSA和BSA中色氨酸残基的E值与其相应的结合平衡常数呈正相关.此外，HSA和BSA中色氨酸残基的个数及所在子域均不同，表明Pyr与HSA和BSA的作用位点可能在不同子域.

Fig.5 Absorption spectrum of Pyr(a)and normalized emission spectra of HSA(b)and BSA(c)to demonstrate the extent of overlap between donor and acceptor

Table 2 Calculated Förster radius(R0)between the donor and the acceptor(λex=295 nm)

2.4 Pyr与HSA和BSA结合位点的差异

为在分子层面获得Pyr与HSA和BSA在结合过程中的作用位点及周围氨基酸残基极性的详细信息，采用Auto Dock4.2.1软件计算了Pyr在HSA和BSA中的最佳结合位点.取Pyr与HSA和BSA对接能量最低的3种构型，Pyr在HSA中位于ⅡA，ⅢA和IB子域结合位点的结合自由能分别为-7.14，-7.04和-6.75 kJ/mol，Pyr在BSA中位于ⅡA，ⅢA和IA子域结合位点的结合自由能分别为-7.79，-7.77和-6.26 kJ/mol，表明Pyr分别与HSA和BSA的结合过程均为自发过程.Pyr在HSA和BSA中不同的结合位点分别是IB子域和IA子域，且其结合位点周围氨基酸残基的极性是影响PyrI1/I3值的主要原因之一.Pyr在HSA中IB子域结合位点周围0.4 nm范围内的非极性氨基酸有Phe149，Phe157，Gly189和Leu154，极性氨基酸有Ser193，His146和Tyr161，离子型氨基酸有Arg186和Lys190［图6（A）］，结合2.1节实验结果，表明IB子域因其不完全疏水而表现出一定极性.

与上文结果比较可知，结合态Pyr与BSA中色氨酸残基的平均距离与IA子域结合位点处的平均距离相一致，BSA中IA子域结合位点周围0.4 nm范围内的非极性氨基酸有Ala253，Ala257，Ala260，Pro151，Leu282，Leu283和Leu14，极性氨基酸有Ser286，His18和Arg256［图6（B）］，表明结合态Pyr在BSA中作用位点周围非极性氨基酸较多，比HSA中结合位点周围微环境的极性更小，该结果与2.1节结合口袋疏水性的实验结果一致.

Fig.6 Molecular docking images of HSA(A)and BSA(B)with Pyr at different binding sites

3 结 论

采用稳态荧光光谱、荧光共振能量转移技术结合分子对接法，证实了微极性探针Pyr分别与HSA和BSA相互作用时，结合位点及其微环境极性不同、与色氨酸残基的作用距离不同.因此，采用BSA代替HSA开展有关PAHs污染物与血清白蛋白相互作用机制研究时，应考虑上述因素.同时，今后若能进一步结合时间分辨荧光光谱、圆二色光谱和竞争结合反应等方法深入研究相互作用时HSA和BSA的构象及生理功能变化的异同，有望更好地从分子水平全面了解PAHs分别与HSA和BSA作用机制的差异.