浙江省温岭地区帕金森病患者DJ-1 基因g.168_185del 的多态性研究

李红娟，郭洁洁，王琳琳

帕金森病（PD）是一种常发生于老年人的锥体外系疾病[1]，大部分为散发，5%～10%为早发型[2]，随年龄的增长，其发病率和患病率也相应增加。近年来基因成为PD 致病原因的研究热点，且研究表明不同基因所致PD 患者的表现具有异质性[3]。DJ-1 基因即PARK7，有剪切位点突变、截短突变和大片段缺失等10 余种不同的突变[4]。本研究探讨浙江省温岭地区DJ-1 基因位点g.168_185del的多态性与PD 发病的关系，报道如下

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016 年11 月至2018 年12 月就诊于浙江省温岭市第一人民医院神经内科及康复科的原发性PD 患者109 例（PD 组），其中男60 例，女49 例；年龄31 ～85 岁，平均（64.4±11.8）岁。另选同期来本院体检中心无PD的健康者105 例（对照组），其中男56例，女49 例；年龄33 ～87 岁，平均（65.6±12.4）岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。

1.2 诊断及排除标准 以英国Brain-Bank 诊断标准进行筛查[5]，有条件者可做颅脑CT 或MRI 检查。排除标准：其他神经系统疾病、继发性PD、帕金森叠加综合征及甲状腺功能亢进等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取 抽取受试者静脉血2 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，使用北京天根中量血提取试剂盒提取DNA。检测DNA 纯度均在1.7 ～1.9，浓度均≥15 ng/ l。抽血前应根据知情自愿的原则签署同意书。

1.3.2 引物设计与合成 运用primer3设计聚合酶链反应（PCR）扩增引物，扩增片段长度为277 bp。扩增的上下游引物详见文献[6]。

1.3.3 PCR 扩增 PCR 反应条件为：在Biometr热循环仪上95℃先预变性5min，再95 ℃变性40 s，再58 ℃退火30 s，后72 ℃变性30 s，再72 ℃10 min，使其得到充分的延伸。PCR 总反应体积为20 l。

1.3.4 PCR扩增产物基因型鉴定 鉴定所扩增259 ～277 bp 部分，该片段如出现TGTGCTGGACGGTGTCCC 18 个碱基序列，判定为g.168_185del 多态位点的插入/插入型，见封三彩图2；该片段18个碱基中1 至多个被其他碱基替换，判定为插入/缺失型，见封三彩图3；如在259 bp18 个碱基完全消失，判定为缺失/缺失型，本研究未见到此种基因型。等位基因频率的计算公式为2n1+n2/2N（n1 为纯合型等位基因数，n2 为杂合型等位基因数，N 为总个体数）。

1.4 统计方法 使用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计数资料比较采用2检验；采用遗传平衡检验基因型资料。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 平衡定律吻合度检验 病例组与对照组进行缺失/插入型、插入/插入型频率差异无统计学意义（均P ＞0.05），两组基因型分布吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg 平衡定律。

2.2 g.168_185del等位基因频率分布比较 两组多态性位点g.168_185del等位基因频率、基因型频率分布差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表1。PD 组与对照组g.168_185del多态性在≤50 岁和＞50 岁间差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2；g.168_185del多态性在男性和女性间差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表3。

3 讨论

据最新流行病学统计，我国65 岁以上人群中PD 发病率与西方发达国家相似，约为1.7%[2]，且发病率随着年龄的增加而增加，但目前对于PD 的确切发病机制尚不明确。

DJ-1 定位于1p36，全长约24 kb，为常染色体隐性遗传致病基因。Eerola 等[7]研究表明病例组和对照组在等位基因频率及基因型频率上均差异无统计学意义。郭纪锋等[8]研究发现在我国PD 患者中DJ-1 基因突变的突变率非常罕见。柳四新等[9]对早发组与晚发组的研究未发现DJ-1 基因差异有统计学意义。本研究显示PD组与对照组间DJ-1 基因g.168_185del的基因型频率及等位基因频率差异均无统计学意义，考虑 g.168_185del多态性与浙江沿海温岭地区PD 无明显相关性。缺失型等位基因频率在PD组为6.4%，PD组等位基因缺失型在早发性大于在对照组的频率，分别为5.8%和4.2%。本研究显示PD 组与对照组g.168_185del 多态性在年龄、性别间差异均无统计学意义。这表明其多态性与年龄、性别关系不大。

表1 两组g.168_185del 等位基因频率和基因型频率分布 例（%）

表2 两组不同年龄间g.168_185del 多态位点基因型频率和等位基因频率比较 例（%）

表3 两组不同性别间g.168_185del 多态位点基因型频率和等位基因频率比较 例（%）

除Hedrick 等[10]报道的DJ-1 基因l～5 号外显子的纯合缺失突变，以及5～7 号的杂合缺失突变外，DJ-1 基因外显子的重排突变很少有报道。Hedrick等通过对100 例早发型PD患者的研究，发现只有2 例有DJ-1 的改变，而17 例患者有Parkin 的突变。蔡苗等[11]研究表明EOPD 组与对照组、家族性及散发性EOPD组与对照组间，g.168_185del多态的基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义。本研究示缺失/插入型突变较缺失/缺失型较多相比，前者相对稍多，后者罕见，而DJ-1 基因g.168_185del在早发PD 中的确切致病作用还有待进一步阐明。由于样本量以及抽样误差等原因，有待扩大样本量进一步研究验证。