TLR4 受体抑制剂对脂多糖促进人黑色素瘤A375 细胞增殖和迁移的影响

郑增光，王鹏雁

恶性黑色素瘤是恶性程度极高的皮肤黏膜恶性肿瘤，常起病隐匿，不易引起重视，确诊时多有淋巴结或远处转移，5年生存率仅16%[1]，且发病率有逐年升高趋势[2]。Toll 样受体（TLRs）是一种模式识别受体，广泛存在于人体免疫细胞及多种上皮细胞中。最近研究表明多种肿瘤细胞表面亦表达TLRs，且与肿瘤的发生、发展及转移密切相关[3-4]。TLR4 是TLRs受体家族中的一员，可通过与配体[如脂多糖（LPS）]结合促进炎症介质的合成与释放。有研究表明TLR4 可促进乳腺癌、卵巢癌及肺癌等肿瘤的增殖、转移及免疫逃逸[3,5-6]。近年发现TLR4 在恶性黑色素瘤组织中的表达比例较高，TLR4的表达增高与患者预后差相关[7-8]。然而，TLR4 在黑色素瘤中发挥何种作用尚不明确。本研究拟采用LPS刺激A375细胞，模拟慢性炎症的细胞微环境，探讨抑制TLR4 的表达对黑素瘤A375 细胞增殖、迁移的影响及其可能的机制，以期为恶性黑色素瘤新的靶点治疗提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 人黑色素瘤A375 细胞株购自上海中科院细胞库；青霉素-链霉素溶液（美国Gibco 公司）、细胞计数试剂盒CCK8（日本同仁生物公司）；胎牛血清、DMEM 细胞培养基（美国Gibco 公司）；LPS（Sigma公司）；Resatorvid（Selleck 公司）；抗体TLR4、-actin（CST 公司）；IL-10 Elisa 试剂盒（酶联生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A375 细胞株采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100 g/ml 链霉素的DMEM 培养基，在5% CO2，37 ℃恒温箱内培养，取其对数生长期用于实验。其中对照组细胞仅接受10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。其他组除10%胎牛血清的DMEM培养基外，另加一定量的LPS 和Resatorvid 并调整相应药物浓度，LPS 组（LPS 5 g/ml）、TLR4 抑制组（Resatorvid 100 mol/L）、LPS+Resatorvid 组（LPS 5 g/ml+Resatorvid 100 mol/L）。

1.2.2 Western blot 检测A375 细胞蛋白表达量 各组细胞根据分组情况，继续培养48h，使用细胞裂解液裂解细胞，然后离心，吸取上清，用二喹啉甲酸（BCA）法检测细胞蛋白浓度。在十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶上对每组取20 g 蛋白上样，在200 V 恒压中电泳，直到溴酚蓝迁移至分离胶下缘时（时间约为40 min），关掉电源，停止电泳。然后经过转膜/封闭，再依次分别加入TLR4、-actin 一抗，孵育过夜，洗膜，使用二抗孵育2h，化学光敏模式曝光显影。照片以TIFF 格式导出后在Image J软件下分析各条带灰度值，以TLR4 与-actin 灰度值比值表示各组TLR4 蛋白的相对表达量。实验重复3 次。

1.2.3 CCK8 实验检测细胞增殖率 制备细胞悬液，将计数细胞接种到96 孔板中，待测细胞调密度至铺满孔底70%左右，设置3 个重复。将96 孔平底板置于5%CO2，37 ℃培养箱中培养24 h，加入10 l CCK-8（日本同仁公司），继续培养1 ～4 h，形成结晶。使用酶标仪450 nm波长检测吸光度（A）值，计算细胞相对增殖率。相对增殖率（%）=（实验组/对照组）×100%。实验重复3 次。

1.2.4 Transwell 法检测细胞迁移能力将300 l无血清培养基加入到小室上层，在其下层加入800 l 培养基，37 ℃细胞培养箱静置2 h，将饥饿处理24h 的细胞进行计数，采用无血清的培养基稀释细胞密度为1×105/ml。去除活化时所用的培养基，分别在小室下层加入800 l 10% FBS 培养液，而小室的上层则加入300 l 细胞悬液。在37 ℃培养箱中培养细胞24 h 后，使用4%甲醇对细胞进行固定20 min，然后进行结晶紫染色。显微镜下拍照（×40），随机选取3 ～5 个视野计数。实验重复3 次。

1.2.5 ELISA 法检测IL-10 的表达水平各组A375 细胞培养48 h后离心取细胞上清液，按照ELISA 试剂盒说明书测定IL-10 含量。采用酶标仪绘制标准曲线，并计算结果。实验重复3 次。

1.3 统计方法 采用SPSS22.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 和Resatorvid 对A375 细胞中TLR4 蛋白表达的影响 LPS 组TLR4蛋白表达高于空白对照组（P ＜0.05），Resatorvid 组TLR4 蛋白表达低于空白对照组（P ＜0.05）；Resatorvid+LPS 组A375细胞TLR4蛋白表达低于单纯LPS组（P ＜0.05）。见图1 及表1。

2.2 LPS 和Resatorvid 对A375 细胞增殖的影响 LPS 组A375 细胞相对增殖率高于空白对照组（P＜0.05），Resatorvid 组A375 细胞相对增殖率低于空白对照组（P ＜0.05），Resatorvid+LPS 组A375 细胞相对增殖率低于单纯LPS 组（P ＜0.05）。见表1。

2.3 LPS 和Resatorvid对A375 细胞迁移的影响 LPS组A375 细胞迁移力高于空白对照组（P＜0.05），Resatorvi组A375 细胞迁移力低于空白对照组（P ＜0.05）；Resatorvid+LPS组A375 细胞迁移力低于LPS组（P ＜0.05）。见封二彩图3 ～6 及表1。

2.4 各组IL-10 的表达情况 LPS 组IL-10 水平高于空白对照组（P＜0.05），Resatorvid 组IL-10 水平低于空白对照组（P ＜0.05），Resatorvid+LPS 组IL-10水平低于LPS 组（P ＜0.05）。见表1。

3 讨论

TLRs是一类天然的免疫受体，最突出的生物学功能是促进细胞因子的合成与释放，大量研究显示生物的炎症介质与LPS 诱导下TLR4 信号通路激活密切相关。TLR4 在肾细胞癌、宫颈癌及肺癌等多种肿瘤及细胞系中过表达，与肿瘤的生长和侵袭迁移密切相关[5,9-10]。有研究表明TLR4 的表达与恶性黑色素瘤的进展、化疗耐药及预后差相关[8,11]。Resatorvid（又名TAK-242）是一种选择性的TLR4 信号传导抑制剂，能抑制TLR4 及下游信号MyD88 的表达。本研究笔者通过在人黑色素瘤A375 细胞系中使用TLR4 受体抑制剂Resatorvid，结果显示与空白对照组相比，Resatorvid 组TLR4蛋白表达下调，A375 细胞的增殖和迁移能力明显减弱（均P ＜0.05）；LPS 刺激A375细胞后，TLR4蛋白表达增加，A375细胞的增殖和迁移能力明显增强（均P＜0.05）；加入Resatorvid后，再给予相同浓度的LPS 刺激，与LPS 组相比，TLR4的表达下调，同时A375 细胞的增殖和迁移能力明显下降（均P ＜0.05）。

图1 各组A375 细胞TLR4 蛋白的表达

表1 各组A375 细胞增殖、迁移能力及TLR4、IL-10 的表达水平比较

IL-10 是肿瘤发展过程中的重要免疫抑制因子，主要由Th2 细胞、单核/巨噬细胞及B 淋巴细胞等合成分泌。研究表明IL-10 参与肿瘤的免疫抑制[12-13]，一方面通过抑制肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达，影响CTL 对肿瘤抗原的识别而发挥免疫逃逸作用；另一方面通过降低肿瘤细胞对NK 细胞的敏感性而发挥作用。有研究发现黑色素瘤肿瘤组织中IL-10 高表达[14]。本研究结果显示A375 细胞系存在IL-10 的表达，与空白对照组相比，Resatorvid 抑制TLR4 的表达后，IL-10 的表达相应降低（P ＜0.05）；LPS 激活A375细胞上TLR4 表达后，IL-10 的表达增加（P ＜0.05）；加入Resatorvid 后再给予相同浓度的LPS刺激，与LPS组相比，IL-10的表达下调（P ＜0.05）。

综上所述，TLR4 抑制剂Resatorvid能明显抑制TLR4 的表达，抑制黑色素瘤A375 细胞的增殖及迁移能力，其作用机制可能是通过影响肿瘤免疫微环境中免疫抑制因子的表达实现的。TLR4 受体有可能成为恶性黑色素瘤潜在的分子治疗靶点。