参松养心胶囊对4种CYP450亚型酶活性的影响

缪志敏，赖 泳

（大理大学药学院，云南大理 671000）

治疗心律失常的西药具有起效快、疗效确切的特点，但副作用大，而抗心律失常中药具有疗效确切、价格便宜、毒副作用小的优点〔1〕，越来越受到患者和临床医生的青睐。参松养心胶囊是北京以岭药业集团根据中医络病理论研制的一种新型治疗心律失常的中药制剂。临床常见参松养心胶囊联用美托洛尔〔2〕、辛伐他汀〔3〕、曲美他嗪〔4〕治疗心律失常；联用胺碘酮〔5〕、华法林〔6〕治疗心力衰竭伴室性心律失常、阵发性房颤；联用比索洛尔治疗室性早搏〔7〕；联用瑞替普酶治疗急性ST 段抬高型心肌梗死〔8〕等，都取得了很好的治疗效果。

细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450），是一种以铁原卟啉为辅基的B 族细胞色素，因其还原态与一氧化碳（CO）作用后，它们形成的复合物在450 nm波长处产生特异吸收峰而命名〔9〕。CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 这4 种CYP450 亚型酶参与临床85% 以上的药物代谢〔10〕。“Cocktail”探针药物法是常用的CYP450 亚型酶活性研究方法，能快速有效地评价药物之间是否存在相互作用。参松养心胶囊成分复杂，未见临床报道其对CYP450酶的影响。本实验采用“Cocktail”探针药物法，选取咪达唑仑、美托洛尔、奥美拉唑、咖啡因4 种探针药物，考察参松养心胶囊对大鼠体内CYP3A1、CYP2D1、CYP2C11、CYP1A2 4 种CYP450 亚型酶活性的影响，预测其存在药物相互作用的可能性，为参松养心胶囊的临床合理利用提供理论依据。

1 材料

1.1 主要实验仪器Agilent 1260 HPLC 工作系统（美国Agilent 公司）；色谱柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美国Agilent 公司）；TARGIN VX-III多管涡旋振荡器（中国北京踏锦科技有限公司）；XW-80A旋涡混合器（中国其林贝尔科技有限公司）；Milli-Q 超纯水机（Millipore，USA）；PremiumC340 超低温冰箱（New Brunswick Scientific）；BCD-539WT冰箱（中国海尔集团）；EL-304电子分析天平（Mettler Toledo）；3-15台式高速离心机（美国Sigma）。

1.2 主要试剂及药品参松养心胶囊（北京以岭药业有限公司，批号：1703008-1703010）；氯化钠注射液（浙江国境药业有限公司，批号：A171019F1）；肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号：51608109）；异氟烷（上海科源制药股份有限公司，批号：160601）；磷酸氢二铵（阿拉丁，批号：J1619003）；氯化钙（西陇化工股份有限公司，批号：150121）；氯化钾（成都市科龙化工试剂厂，批号：016022401）；TRIS（北京索莱宝科技有限公司，批号：1217S0713）；磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝科技有限公司，批号：113I0227）。

1.3 动物雄性SD 大鼠24 只，体质量（200±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

2 方法

2.1 溶液的配制“Cocktail”探针药物溶液配制方法：准确称取咖啡因20 mg、奥美拉唑20 mg、美托洛尔40 mg溶于6 mL 0.9%氯化钠溶液中，同时加入咪达唑仑注射液5 mL（相当于10 mg），即配制成“Cocktail”探针药物溶液。参松养心胶囊溶液配制方法：根据《药理实验方法学》〔11〕临床常用剂量并通过不同种动物剂量换算公式计算，最终确定大鼠高、中、低给药剂量分别是756、378、189 mg∕kg。分别精密称取参松养心胶囊7.560、3.780、1.890 g，用双蒸水定容到50 mL，超声溶解30 min。含地西泮内标（internal standard，IS）终止反应液配制方法：精密吸取2 mL 地西泮注射液（5 mg∕mL）用超纯水定容在5 mL 棕色容量瓶中，混合均匀配制成浓度为2 mg∕mL 的地西泮标准品储备液，4 ℃冰箱中保存。精密吸取一定量的内标储备液，用超纯水溶液稀释成浓度为100 μg∕mL 的内标工作液，4 ℃冰箱中保存。

2.2 动物分组及给药方法将24 只SD 雄性大鼠随机分为参松养心胶囊高、中、低剂量组和空白组4个组，每组6 只。参松养心胶囊高、中、低剂量组给药剂量分别为756、378、189 mg∕（kg·d），每天给药一次，连续给药15 d，给药期间对大鼠进行正常喂养；空白组大鼠正常喂养。第16天，各组大鼠分别按照5 mL∕kg剂量给予腹腔注射“Cocktail”探针药物溶液。

2.3 血浆样品采集和处理方法在给药前和给药后5、10、20、40 min 及1.0、1.5、2.0、5.0、8.0、12.0、24.0 h尾静脉真空采血管取血300 μL至肝素钠处理过的1.5 mL 的EP 管中，以3 000 r∕min 离心10 min，吸取上层血浆100 μL 于新的1.5 mL EP 管中，加入10 μL 地西泮溶液（100 μg∕mL），涡旋混匀30 s，加入400 μL 乙腈，涡旋振荡5 min，离心10 min，取上清液过0.22 μm的滤膜，20 μL进样分析。

2.4 色谱条件Agilent 1260 HPLC工作系统；色谱柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.5 mL∕min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.5 药代动力学参数分析利用DAS 3.0软件采用非房室模型法计算各探针药物的药代动力学参数，包括AUC（0-24）、MRT（0-24）、t1∕2、CL。

2.6 数据处理和统计分析使用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，计量资料均以（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析方法，Dunnett′st检验进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HPLC 方法学验证在“2.4”色谱条件下，血浆中咖啡因、奥美拉唑、美托洛尔、咪达唑仑和内标地西泮峰形较好，分离完全，无杂峰干扰，其保留时间分别是8.10、10.20、13.20、14.50 和19.52 min，色谱图见图1。分别以各探针峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，探针底物浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线方程。咖啡因：y=0.419 9x-0.247 2，r=0.991 9；美托洛尔：y=0.835 9x-0.051 0，r=0.992 2；奥美拉唑：y=0.221 5x-0.031 2，r=0.995 6；咪达唑仑：y=0.451 2x+0.727 9，r=0.992 8。各探针的标准曲线最小浓度其精密度和准确度的相对标准偏差均小于15%（n=3），符合生物样品中药物分析要求，可作为分析方法的定量下限（low limit of quantification，LLOQ）。

3.2 4 种探针药物血药浓度-时间曲线测定结果参松养心胶囊高、中、低剂量组和空白组大鼠分别腹腔注射探针药物，按“2.4”项下处理，测得4 种探针药物的血药浓度，结果见图2。

3.3 4种探针药物药代动力学参数分析结果咖啡因、奥美拉唑、美托洛尔、咪达唑仑的主要药代动力学参数计算结果见表2。结果显示，与空白组比较，参松养心胶囊3个剂量组咖啡因的AUC（0-24）均增大，高剂量组的AUC（0-24）明显增大，差异具有统计学意义（P＜0.05），MRT（0-24）均增大，t1∕2均有延长，CL均有降低，但差异没有统计学意义（P＞0.05）；参松养心胶囊3个剂量组奥美拉唑的AUC（0-24）显著增大，MRT（0-24）均增大，差异均具有统计学意义（P＜0.05），t1∕2均有延长，低剂量组的CL升高，中、高剂量组的CL降低，差异均无统计学意义（P＞0.05）；参松养心胶囊3个剂量组美托洛尔的MRT（0-24）均增大（P＜0.05），咪达唑仑的AUC（0-24）明显增大（P＜0.05），低、高剂量组的MRT（0-24）明显增大（P＜0.05），其他药代动力学参数差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各分析物及内标的HPLC图

图2 4种探针药物平均血药浓度-时间曲线图

表2 不同剂量参松养心胶囊对大鼠体内4种探针药物的药代动力学参数的影响（xˉ± s，n=6）

4 讨论

20世纪90年代初，Breimer和Schellens〔12〕就提出了“Cocktail”探针药物法。“Cocktail”探针药物法是指一种为获取多个代谢酶的表型信息，首先同时给予多种相对低剂量的探针药物，然后测定生物样本中各个探针药物的代谢率或者其他代谢分型指标的方法〔13-14〕。已有研究报道，大鼠体内主要参与代谢的亚型酶为CYP1A2、CYP2C、CYP3A、CYP2E1〔15〕，并且在雄性大鼠体内CYP3A 的活性是雌性大鼠的5～10 倍，与人类相似，因此雄性大鼠常用来研究预测药物对CYPs酶活性是否产生相互影响。

结果显示，与空白组相比，咖啡因组药代动力学参数无明显变化，表明参松养心胶囊对CYP1A2（相当于人源CYP1A2 酶）活性没有明显作用。3 个浓度的参松养心胶囊使奥美拉唑、美托洛尔、咪达唑仑的代谢减慢，表明参松养心胶囊对CYP2C11（相当于人源CYP2C19 酶）、CYP2D1（相当于人源CYP2D6 酶）、CYP3A1（相当于人源CYP3A4 酶）活性可能存在抑制作用。参松养心胶囊对大鼠体内美托洛尔的药代动力学参数t1∕2的影响中，低剂量组的t1∕2明显高于其他剂量组，结合其他药代动力学参数，分析存在以下两个原因：①在体内实验中，先给予大鼠参松养心胶囊预处理15 d 后，药物在体内经过吸收、分布、代谢、排泄的过程，再给予混合探针药物考察它们的代谢变化容易受到个体生理差异的影响；②待测中成药成分复杂，每一味药之间可能存在相互作用，对大鼠体内CYP2D1 酶活性的影响是原型药物的多种组分起作用还是其代谢产物起作用，还尚不清楚。因此参松养心胶囊是否在临床应用时产生抑制作用需再进行人肝微粒体或与人体合并用药进一步验证。

研究表明，人CYP2D6酶参与抗心律失常药（胺碘酮、利多卡因等）、镇痛药（曲马多、美沙酮、吗啡等）、抗精神病药（利培酮、奋乃静等）、抗癌药（他莫昔芬等）、抗抑郁药（去甲基西酞普兰等）的代谢〔16〕。CYP2C19 酶会代谢质子泵抑制剂、三环抗抑郁药、SSRI、SNRI、巴 比 妥 酸 盐 和 抗 血 小 板 药 物〔17〕。CYP3A4 酶参与心血管疾病临床用药的代谢更为广泛，包括抗心律失常药（利多卡因、普罗帕酮、普鲁卡因胺等）、抗动脉粥样硬化药（吉非贝齐、氟伐他汀、辛伐他汀）、钙拮抗剂（维拉帕米、硝苯地平、氨氯地平等）〔18〕。结合本实验研究结果，在参松养心胶囊与以上相应酶底物合用时，应及时关注可能存在的药物相互作用，并进行血药浓度监测，以尽可能地减少由药物相互作用引发的不良反应。