松郁安神方对PCPA致失眠大鼠睡眠时相的影响

曾雪爱 周春权 吴华嵩 黄俊山

(福建省中医药科学院，福州，350003)

睡眠和觉醒是人的一生中反复交替出现的2种生理状态，但随着现代生活节奏的加快，睡眠与觉醒的平衡常常被破坏，从而引起失眠。长期失眠不仅影响人们的生命质量和身心健康，而且常会加重或诱发心悸、胸痹、眩晕、头痛、中风等[1]。目前，传统镇静催眠药可以改善失眠患者的睡眠，但存在耐受或依赖等不良反应[2]，近年来，对于中医药治疗失眠开展了广泛的研究，发现许多中草药具有良好的镇静安神作用，而且不良反应小。

松郁安神方为国家重点专科(神志病)学术带头人、第六批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师、福建省名中医黄俊山教授临床经验方，由甘松、郁金、玫瑰花、酸枣仁、柴胡、珍珠母、生龙骨、合欢皮、丹参组成，是临床上治疗失眠的经验效方[3-4]。本实验采用动物睡眠生物解析系统24 h连续记录大鼠脑电和肌电活动，观察松郁安神方对PCPA致失眠大鼠睡眠时相(觉醒期、非快速眼动睡眠期、快速眼动睡眠期)的影响，客观评价松郁安神方改善睡眠的作用。

1 材料

1.1 动物 清洁级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，体质量(230±10)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005；合格证编号：20170005004461]。动物置于安静、恒温恒湿、12 h/12 h明暗光照环境中饲养，可自由饮水和进食。

1.2 试剂与仪器 PCPA(Sigma公司，批号：SHBH7873)、自凝牙托水(上海齿科材料厂，批号：01-09-15)、自凝牙托粉(上海珊瑚化工厂，批号：01-11-15)、注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂，批号：A02126012)、中药饮片(福建鹭燕药业股份有限公司)、动物睡眠生物解析系统(KisseiComtec，日本)、68003脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

2 方法

2.1 中药制备 松郁安神方组成：甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、酸枣仁15 g、柴胡15 g、珍珠母30 g、生龙骨30 g、合欢皮15 g、丹参15 g。药物经煎煮及过滤浓缩至3.4 g/mL备用。

2.2 PCPA失眠模型建立 按照参考文献[5]的方法，于临用前按照300 mg/kg用量，将PCPA溶于弱碱性生理盐水，配制成混悬液，按10 mL/kg体质量腹腔注射，连续2 d，1次/d。

2.3 动物分组与给药 将大鼠随机分为3组：空白对照组、PCPA失眠模型组、松郁安神方组，每组4只。松郁安神方组按17 g/kg体质量灌胃给药，空白对照组和失眠模型组均给予同等体积蒸馏水灌胃，1次/d，共7 d。

2.4 大鼠头部电极埋植手术 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，将头部手术区剃毛，脑立体定位仪固定。剪开皮肤，分离皮下组织，使颅骨完全暴露。分别于前囟前1.0 mm，旁开1.5 mm和后囟前1.0 mm，旁开1.5 mm钻孔(钻通颅骨，但未穿破硬脑膜)，将2个与采集EEG电极相连的不锈钢螺丝固定于颅骨的钻孔中，在后囟另一侧钻孔(未钻通颅骨)，将一个与参比电极相连的不锈钢螺丝固定于颅骨的钻孔中，用牙托粉将3个电极封固于颅骨上。另外两根采集EMG的电极分别插入两侧颈部斜方肌中。所有的电极都连接到一个微型连接器上，并用牙科水泥固定在头骨上。缝合创口，术后腹腔注射青霉素钠，恢复7 d后进行实验。

2.5 大鼠睡眠时相的记录和分析 末次灌胃给药后，将大鼠置于记录笼中，连接记录系统，进行记录。记录时EEG和EMG信号通过大鼠头部电极，途经多通道万向轮，经初步放大后将信号接入到放大器。信号经滤波后，进一步放大，输入到电脑，经模数转换最终获得数字信号。记录从第1天的19:00点开始，到次日19:00点结束，连续24 h记录自由活动大鼠的EEG和EMG。记录结束后，用SleepSign分析软件，根据统一设定的标准扫描记录的EEG/EMG信号，自动判别出觉醒(W)期、NREM期和REM期。扫描完成后，进行人工检查，必要时改正。

3 结果

3.1 注射PCPA对大鼠的睡眠时相的影响 为了检验PCPA失眠模型是否成功，采用动物睡眠生物解析系统记录大鼠EEG/EMG信号。图1是大鼠睡眠过程中的3个状态：觉醒期(W)、非快速眼动睡眠期(S)、快速眼动睡眠期(R)。W期以高频低幅的脑波为主，伴有明显的肌电活动，S期以低频宽幅的Delta波为主，EMG活动不明显，R期以Theta波为主，EMG信号基本没有。

图1 大鼠各睡眠时相

大鼠给予PCPA造模后，24 h时间过程NREM、REM睡眠量和觉醒量变化情况见图2A，大鼠昼夜12 h NREM、REM睡眠总时间和觉醒总时间见图2B。如图2A所示，24 h时间过程的变化表明，与正常对照组比较，失眠模型组在夜晚(19:00～次日7:00)，NREM睡眠时间在1:00时段差异有统计学意义(P<0.01)，REM睡眠时间在24:00时段差异有统计学意义(P<0.05)，觉醒时间在24:00、1:00、6:00这3个时段差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；在白天(7:00—19:00)，NREM和REM睡眠时间较正常对照组明显减少，觉醒时间明显增加，其中NREM睡眠时间在7:00、8:00、11:00、14:00、17:00这5个时段差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，REM睡眠时间在10:00、14:00、17:00这3个时段差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，觉醒时间在7:00、11:00、12:00、14:00、17:00这5个时段差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。如图2B显示，在夜晚，与正常对照组比较，失眠模型组12 h NREM睡眠总时间、REM睡眠总时间虽然减少，但差异无统计学意义(P>0.05)；在白天，12 h NREM和REM睡眠总时间较正常对照组均明显减少，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，而觉醒总时间明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 注射PCPA对大鼠睡眠时相的影响

3.2 松郁安神方对PCPA致失眠大鼠睡眠时相的影响 连续7 d给予松郁安神方后，如图3A所示，24 h时间过程的变化表明，与PCPA失眠模型组比较，松郁安神方组在夜晚(19:00～次日7:00)，NREM睡眠时间在20:00、1:00、5:00这3个时段差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，REM睡眠时间在22:00、5:00、6:00这3个时段差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，觉醒时间在20:00、22:00、1:00、5:00、6:00这5个时段差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；在白天(7:00～19:00)，松郁安神方组NREM和REM睡眠时间较PCPA失眠模型组明显增加，觉醒时间明显减少，其中NREM睡眠时间在7:00、11:00、16:00这3个时段差异均有统计学意义(P<0.05)，REM睡眠时间在7:00、13:00、14:00、16:00、17:00、18:00这6个时段差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，觉醒时间在7:00、11:00、14:00、16:00、17:00这5个时段差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

图3 松郁安神方对PCPA致失眠大鼠睡眠时相的影响

图3B显示，与失眠模型组比较，在夜晚，松郁安神方组12 h NREM睡眠总时间、REM睡眠总时间增加，其中REM睡眠总时间有统计学意义(P<0.05)，觉醒总时间则明显减少(P<0.05)；在白天，12 h NREM、REM睡眠总时间较失眠模型组均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而觉醒总时间明显减少，差异有统计学意义(P<0.001)。

4 讨论

松郁安神方以甘松、郁金、玫瑰花为君药，配伍酸枣仁、柴胡、生龙骨、珍珠母、合欢皮、丹参组方，实验室前期临床研究证实松郁安神方治疗失眠疗效显著[3-4]，动物实验也证实它可以提高PCPA致失眠大鼠抑制性神经递质的含量[6]，本研究旨在通过观察大鼠EEG/EMG变化，客观地评价松郁安神方改善睡眠的作用。

PCPA致失眠模型是目前公认的动物模型。其原理是由于PCPA是脑内色氨酸羟化酶的抑制剂，能阻滞脑内5-HT的生物合成，使5-HT的含量显著下降，从而使动物出现完全性失眠[7]。目前脑电图仍是评价睡眠效率的金指标。动物睡眠生物解析系统可屏蔽外界信号干扰，实时、高效、稳定、自动记录与分析动物睡眠觉醒状情况[8]，本研究采用此系统24 h连续记录EEG/EMG信号，观察大鼠睡眠过程中3个主要时期：觉醒期、非快速眼动睡眠期、快速眼动睡眠期的实时变化，结果发现腹腔注射PCPA可以降低白天(7:00～19:00)时段NREM和REM睡眠总时间，增加觉醒时间，与正常对照组有统计学差异，说明失眠模型造模成功，而连续7 d给予松郁安神方后可以明显增加白天(7:00～19:00)时段NREM和REM睡眠总时间，降低觉醒时间，与PCPA失眠模型比较有统计学差异，表明松郁安神方具有明显的镇静安神作用，其主要从通过增加白天时段NREM和REM睡眠总时间改善睡眠。