从浙江选考命题角度解读“原生质体”的疑难问题

严灵剑

摘要 从原生质体获取、纯化、培养、分裂和活性鉴定五个方面，深入解读了近几年浙江选考题中涉及原生质体的疑难问题。

关键词 原生质体 教学疑难 生物选考

中图分类号 G633.91

文献标志码 B

原生质体研究的热潮开始于20世纪80年代早期，并在随后的几年中逐步深入。目前，包括园艺植物在内的近400种植物已成功实现原生质体的分离。而且高等植物的原生质体已广泛的用于细胞融合、摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒等研究。在浙江省的选考试题中会经常出现原生质体的影子。

1原生质体是否一定要用纤维素酶和果胶酶来获取

分离原生质体常用的酶有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶。一般来说，分离叶肉细胞和悬浮细胞的原生质体时只需纤维素酶和果胶酶即可。纤维素酶消化细胞壁的纤维素，果胶酶主要降解中胶层。分离愈伤组织原生质体时，加上半纤维酶来降解细胞壁中的半纤维素，分离效果会更好，酶的用量和酶解时间需适当增加。由此可见，原生质体的取材来源直接决定了所需酶的种类。

[例1]（2016年浙江选考T32）（节选）（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的的混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。

分析：这题是从叶片进行处理来获得原生质体，类似于从叶肉细胞中分离原生质体，所以要加纤维素酶和果胶酶。

参考答案：纤维素酶和果胶酶。

2原生质体为什么要纯化及如何纯化

细胞酶解后的混合物中，除完整未损伤的原生质体外，还含有许多杂质，如细胞碎片、叶绿体、维管束成分、未被消化的细胞组织和破裂的原生质体。因而必须把这些杂质除掉。清除较大碎屑的方法是使酶解后的混合物穿过一个50～70μm的镍丝网进行过滤。然后，再利用密度，通过多次离心，取某一界面物或是除去上清液，进一步纯化。最后，获得纯净的原生质体。由此可见，酶解后的混合物经过过滤、离心等纯化步骤后，才能获得想要的原生质体。

[例2]（2016年浙江选考T32）（节选）（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的纤维素酶和果胶酶的混合液处理，经过后获得原生质体。

分析：在获取原生质体的过程中会混有杂质，可以通过过滤初步纯化，再通过离心进一步纯化。

参考答案：离心纯化。

3原生质体培养过程中何时降低渗透压在原生质体还没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，必须有培养基渗透压的保护。培养基中的渗透压一般是用0.5～0.6mol/L甘露醇或山梨醇调节的。培养开始后7～10d，大部分有活力的原生质体已经再生出细胞壁并进行了几次分裂，此后通过定期加入几滴不含渗压剂或渗压剂水平很低的新鲜培养基，可使培养基的渗透压逐渐下降（若还把渗压剂保持在原来的高水平上，若干时间以后细胞就会停止分裂）。最后，将肉眼可见的细胞团转入到不含渗压剂的新鲜培养基中。由此可见，原生质体培养基中的渗透压应该在细胞分裂几次后，用渗透压相对较低的渗压剂来降低培养基中的渗透壓，直至用不含渗压剂的新鲜培养基来培养细胞团。

[例3]（2016年浙江选考T32）（节选）（2）原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。

分析：如果保持获得原生质体时的渗透压将会阻止细胞的分裂，从而无法获得细胞团。

参考答案：降低。

4原生质体何时进行细胞分裂

在原生质体混合物中，一旦把酶洗掉，原生质体立即开始合成新壁。一般来说，来源于已分化的初始材料，其原生质体相比于未分化材料的原生质体合成细胞壁的能力要弱。细胞壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂。凡能继续分裂的细胞经2～3周培养后可长出细胞团。由此可见，原生质体只有在再生细胞壁后，才能进行细胞分裂。[例4]（2020年1月浙江选考T29）原生质体在培养过程中，只有重新形成后，才可进行有丝分裂。

分析：细胞壁的形成直接影响了原生质体的分裂。不能再生细胞壁的原生质体将难以进行分裂。

参考答案：细胞壁。

5原生质体的活性如何鉴定

原生质体活动检测方法有形态观察法、二乙酸荧光素法、酚藏花红染色法、伊文斯蓝染色体法。1形态观察法，主要观察原生质体形态及胞内环流。有活力的原生质体形态规则完整，颜色鲜艳，胞内环流明显;无活力原生质体胞内浑浊，无色泽且透光，胞内环流不显著。2酚藏花红染色法，其原理是活性原生质体染色后在荧光显微镜下可观察到红色;而无活性原生质体无色。3伊文斯蓝染色法。其原理就是死细胞或受损细胞可吸收伊文斯蓝，而完整活细胞不吸收或积累该物质。4二乙酸荧光素法。该方法的原理是FDA自由穿越细胞膜，并积累在活细胞中，被活细胞酯酶酶解产生荧光素。在荧光显微镜下可以观察荧光产生。而荧光素无法在死细胞中积累。因此，无活力的原生质体无荧光产生。由此可见，原生质体的活性可以通过形态观察，着色等方法进行鉴定。

[例5]（2020年1月浙江选考T29）（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有（答出2点即可）。

分析：该题中提到的染色法，可以是酚藏花红染色法，也可以是伊文斯蓝染色法，也可以参考浙科版教材中“验证活细胞吸收物质的选择性”活动中的红墨水染色。还可以用形态观察法，观察胞质环流的情况。该题中提到的渗透吸水失水，是参考浙科版教材中“观察洋葱表皮细胞的质壁分离及质壁分离复原”活动，能发生渗透吸水失水的是活细胞。

参考答案：染色法、渗透吸水失水。

参考文献：

[1]陈劲枫.植物组织培养与生物技术[M].北京：科学出版社，2018.

[2]李浚明朱登云.植物组织培养教程[M].北京：中国农业大学出版社，2005.

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