薄层色谱法和高效液相色谱法在柴苓清肝丸质量控制中的应用价值

彭善祥，杜希扬，范天柱，朱玉苹

（临沂市中医医院，山东 临沂 276002）

中成药具有成分多样的特点。中成药的质量控制一直是中医药领域研究的难点。柴苓清肝丸由柴胡、茯苓、牡丹皮、黄芪、黄芩、黄连、赤芍、郁金、薏苡仁等19 味中药组成。我院常用柴苓清肝丸治疗肝郁脾虚、湿毒内蕴之证[1]。临床上常用薄层色谱法和高效液相色谱法对药物进行质量控制。本次研究主要是分析薄层色谱法和高效液相色谱法在柴苓清肝丸质量控制中的应用价值。

1 仪器与试药

本次实验使用的仪器是KDM 型连续可调控温电热套（山东省鄄城华鲁电热仪器有限公司生产）、ZF-2 型三用紫外分析仪（邢台润联科技开发有限公司生产）、TG328A（S）分析天平（上海精密科学仪器有限公司生产）、ZB-1A型智能崩解仪（上海黄海药检仪器有限公司生产）、电热恒温鼓风干燥箱（沧州双兴仪器设备有限公司生产）、硅胶G( 青岛海洋化工有限公司生产)。本次实验使用的试药是丹皮酚（110708-201407）、黄芪甲苷（0781-200210）、黄连（120913-201611）、黄芩苷（110715-201720）、芍药苷（110738-201337），这些试药均购自于中国药品生物制品检定所。本次实验使用的试剂均为分析纯级别，使用的水均为纯化水。本次实验使用的三个批次的柴苓清肝丸（批号分别为20170401、20170413、20170421）均购自于临沂市中医医院中药制剂中心。

2 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中相关成分的方法及结果

2.1 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中牡丹皮的方法及结果

取1g 的柴苓清肝丸粉末，将其加入到试管中，另在试管中加入10ml 的乙醚。密塞试管，振摇10 分钟后进行滤过处理。挥干滤液中的溶剂，在残渣中加入2ml 的丙酮，使其溶解，将此溶液作为供试品溶液。另取适量的丹皮酚对照品，加入丙酮，制成每1ml 中含有2mg 丹皮酚对照品的溶液，将此溶液作为对照品溶液。取处方中除牡丹皮以外的其他药物，按照处方的比例制成独缺牡丹皮的阴性对照样品。按照制备供试品溶液的方法，将独缺牡丹皮的阴性对照样品制成阴性对照溶液[2]。吸取上述两种溶液各10μl，将其分别点在同一个硅胶G 薄层板上。将环己烷- 乙酸乙酯- 冰醋酸（4:1:0.1）作为展开剂对硅胶G 薄层板上的溶液进行展开处理，然后取出、晾干，喷上浓度为2% 的香草醛硫酸乙醇溶液。将硅胶G 薄层板放到105℃的环境中加热至斑点显色清晰。检视供试品色谱，在与对照品色谱相应的位置上若显现出相同颜色的主斑点，表示检测结果为阴性，无干扰。对三批样品进行检验的结果显示，此法的操作简便，重现性良好。见图1。

图1 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中牡丹皮的结果

2.2 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中黄芪的方法及结果

取17 g 的柴苓清肝丸，将其研磨呈粉末。在柴苓清肝丸粉末中加入50ml 的甲醇，经超声处理30 分钟后，进行滤过处理。将滤液蒸干，在残渣中加入30ml 的水，使其溶解，用经水饱和处理的正丁醇提取2 次（30ml/ 次），合并正丁醇液。加三倍量的氨试液，摇匀，放置，使其分层，蒸干正丁醇液。在残渣中加入1ml 的甲醇，使其溶解，将此溶液作为供试品溶液[3]。另取适量的黄芪甲苷对照品，在此对照品中加入甲醇，制成每1ml 中含有1mg 此对照品的溶液，将此溶液作为对照品溶液。取处方中除黄芪以外的其他药品，按照处方的比例制成独缺黄芪的阴性对照样品。按照制备供试品溶液的方法将独缺黄芪的阴性对照样品制成阴性对照溶液[4]。分别吸取5 μl 的供试品溶液、5 μl 的阴性样品溶液、2 μl 的对照品溶液，将上述溶液分别点在同一个硅胶G 薄层板上。将三氯甲烷- 甲醇- 水（13:7:2）放置在10℃的环境中，放置使其分层，取下层溶液作为展开剂对硅胶G 薄层板上的溶液进行展开处理，取出、晾干，喷上10% 的硫酸乙醇溶液。将硅胶G 薄层板放到105℃的环境中加热至斑点显色清晰。在紫外光灯（波长为365nm）下进行检视，在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上若显现出相同颜色的斑点，表示检测结果呈阴性，无干扰。对三批样品进行检验的结果显示，此法的操作简便，重现性良好。见图2。

图2 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中黄芪的结果

2.3 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中黄连的方法及结果

取0.25g 的柴苓清肝丸，将其研磨呈粉末。在此粉末中加入25ml 的甲醇，超声处理30 分钟后，进行滤过处理，将滤液作为供试品溶液。另取0.25g 的黄连对照药材，采用同样的方法制成对照药材溶液。取处方中除黄连以外的其他药品，按照处方的比例制成独缺黄连的阴性对照样品。按照制备供试品溶液的方法，制成独缺黄连的阴性对照样品[5]。吸取上述三种溶液各1μl，分别点在同一个高效硅胶G 薄层板上。将环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）作为展开剂，将此试剂置于用浓氨试液预饱和处理20 分钟的展开缸内进行展开处理后，取出、晾干，置于紫外光灯（波长为365nm）下进行检视。在检视的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上若显现出相同颜色的主斑点，表明检测结果呈阴性，无干扰。对三批样品进行验证的结果显示，此法的操作简便，重现性良好。见图3。

图3 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中黄连的结果

2.4 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中黄芩的方法及结果

取1g 的柴苓清肝丸粉末，将其加入到30ml 的乙酸乙酯-甲醇（3:1）混合溶液中。将此溶液加热、回流30 分钟后，放冷、滤过，蒸干滤液。在残渣中加入5ml 的甲醇，使其溶解，取上清液作为供试品溶液。取黄芩苷对照品，将其加入到甲醇中，制成每1ml 中含有1mg 黄芩苷对照品的溶液，将此溶液作为对照品溶液。取处方中除黄芩以外的其他药品，按照处方的比例制成独缺黄芩的阴性对照样品[6]。吸取上述三种溶液各2μl，分别点在同一个硅胶G 薄层板上。将甲苯-乙酸乙酯- 甲醇- 甲酸（10:3:1:2）作为展开剂，预饱和处理30 分钟后，将硅胶G 薄层板展开、取出并晾干，置于紫外光灯（波长为365nm）下检视。在检视的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上若显现出相同颜色的主斑点，表明检验结果呈阴性，无干扰。对三批样品进行验证的结果显示，此法的操作简便，重现性良好。见图4。

图4 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中黄芩的结果

2.5 用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中赤芍的方法及结果

取0.5g 的本品粉末，将其加入到10ml 的乙醇中，振摇5 分钟后，滤过，蒸干滤液。在残渣中加入2ml 的乙醇，使其溶解，将此溶液作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，在此对照品中加入乙醇，制成每1ml 中含有2mg 此对照品的溶液，将此溶液作为对照品溶液。取处方中除赤芍以外的其他药品，按照处方的比例制成独缺赤芍的阴性对照样品。按照制备供试品溶液的方法，制成阴性对照溶液[7]。吸取上述三种溶液各4μl，分别点在同一个硅胶G 薄层板上。将三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）作为展开剂，对硅胶G 薄层板进行展开处理后，取出、晾干，喷上5%的香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。在检视的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上若显现出相同颜色的主斑点，表示检验结果为阴性，无干扰。经三批样品验证，此法的操作简便，重现性良好。见图5。

3 用高效液相色谱法检测柴苓清肝丸中丹皮酚含量的方法及结果

采用蒸馏- 煎煮法和超声提取法提取丹皮酚。结果显示，经超声提取获得丹皮酚的提取量较高[8]。考虑到提取方法的省时性，故采用甲醇作为溶剂，采用超声提取30 min的方法提取柴苓清肝丸中的丹皮酚[9]。

3.1 色谱条件

本次实验使用的色谱柱为WondaSil C18 色谱柱（4.6×150mm，5μm），流动相为甲醇- 水（45:55）。流动相的流速为1ml/min，检测波长为274nm，柱温为25℃，按照丹皮酚峰计，理论板数应不低于3000。

3.2 制备溶液的方法

本次实验使用的溶液包括供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液。1）制备供试品溶液的方法是：精密称取2.047g 的柴苓清肝丸，将其置于50ml 的容量瓶中。在容量瓶中加入适量的甲醇，经超声处理（功率为250W，频率为50 KHz）30 分钟后，放冷，用甲醇定容至50ml，摇匀后进行离心处理，取上清液。对上清液进行滤过处理，取续滤液，即得本次实验的供试品溶液。2）制备阴性对照品溶液的方法是：去除处方中的牡丹皮，制成阴性样品。按照制备供试品溶液的方法制备阴性对照品溶液。3）精密称取0.6mg的丹皮酚对照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有120 μg 丹皮酚的溶液，即得本次实验的对照品溶液。将制备好的供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液分别注入到色谱仪中进行检测。本次实验供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液的色谱图见图6。

图6 本次实验供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液的色谱图

3.3 进行线性关系考察实验的方法及结果

精密称取1.2mg 的丹皮酚对照品，加入甲醇，制成每1ml中含有120 μg 丹皮酚的溶液，即得本次实验的丹皮酚对照品溶液。精密量取1ml 的丹皮酚对照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有96 μg 丹皮酚的溶液。精密称取1ml 第一个丹皮酚对照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有60 μg 丹皮酚的溶液。精密称取1ml 第二个丹皮酚对照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有30 μg 丹皮酚的溶液。精密称取1ml 第三个丹皮酚对照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有15 μg丹皮酚的溶液。分别吸取10μl 这四种浓度的对照品溶液，将其分别注入到液相色谱仪中。测得丹皮酚的峰面积，回归方程f(x)=0.9226x+1.1884，R=0.9996。结果表明，丹皮酚在15 ～120 μg/ml 范围内的线性关系良好。见图7。

3.4 进行精密度实验的方法及结果

精密吸取浓度为120μg/ml 的对照品溶液，按照本次实验的色谱条件连续进样6 次，考察色谱峰相对保留时间和峰面积比值的一致性。结果表明，RSD 值为0.5%，符合指纹图谱研究的技术要求。

3.5 进行重复性实验的方法及结果

取同一批次的样品（批号为20170401），制备六份供试品溶液。按照本次实验的色谱条件分别进样测定，色谱峰相对保留时间和峰面积比值无明显变化，RSD 值为0.5%。这表明，本次实验的重复性良好。

3.6 测定柴苓清肝丸中丹皮酚含量的方法及结果

取3 个批号的柴苓清肝丸，制备六份供试品溶液。按照本次实验的色谱条件测定三个批号柴苓清肝丸样品中丹皮酚的含量。测得的RSD 值分别为1.1%、1.2%、1.8%，丹皮酚的含量分别为960 μg/g、940 μg/g、953 μg/g，丹皮酚含量的平均值为951 μg/g。见表1。

表1 三个批次柴苓清肝丸中丹皮酚含量的测定结果

4 讨论

在本次研究中，采用薄层色谱法鉴别柴苓清肝丸中的牡丹皮、黄芪、黄连、黄芩、赤芍。研究结果证实此鉴别方法的专属性强，操作简便。用高效液相色谱法对柴苓清肝丸的主要成分丹皮酚进行含量测定。结果显示，此法的灵敏度高、重现性好，这为柴苓清肝丸的质量控制和进一步研究提供了参考依据。