陕西省丙型肝炎病毒基因型分布特征

刘媛媛，刘娜，付建军，李红兵，黄辉红，宁博，唐先梅，何英利，赵英仁，刘锦锋

1.西安交通大学第一附属医院感染科，陕西 西安 710061；2.西安市中心医院感染科，陕西 西安 710003；3.延安大学第一附属医院感染科，陕西 延安 716000；4.渭南市中心医院感染科，陕西 渭南 714000；5.安康市中心医院感染科，陕西安康 725000；6.宝鸡市中心医院感染科，陕西 宝鸡 721000；7.汉中3201医院感染科，陕西 汉中 723099

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)为黄病毒科的一种，大小为55～65 nm，有包膜的正单链RNA 病毒。丙型肝炎病毒是由哈维·奥尔特、迈克尔·霍顿和查尔斯·M·赖斯所发现，并且三人均在2020年获得诺贝尔医学奖。丙型肝炎病毒在体内感染后6 个月内，因约80%的患者无明显临床症状，从而错过了最佳治疗时期。丙型肝炎病毒在体内持续潜伏，导致肝脏慢性炎症，进而发展为肝硬化及肝癌，因此丙肝已成为我国乃至世界主要的公共卫生问题，严重威胁着人类的生命健康。由于HCV 病毒聚合酶缺乏校正功能的特点，使其自身基因组序列容易发生变异，目前研究已发现7个基因型及100多种亚型。不同基因型与肝病进展、肝癌发生及抗病毒药物疗效等密切相关。不同地区HCV基因型分布特点与感染、传播路线密切相关，由于人口流动性增加及感染途径的变化，HCV 基因型的分布也不断变化。探讨HCV 基因型的地域分布特征对于了解HCV病毒传播路线、制订合理而有效的诊疗方案、制订合适的防控措施具有重要的研究价值。相关资料显示，陕西省大样本的HCV基因分型数据缺乏，因此，本研究对陕西省陕南、关中、陕北三个主要地理区域HCV感染者进行基因分型，以了解陕西省HCV基因型的分布特征，为丙肝的治疗及预防提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年12月在陕西省7 家市级医院(西安交通大学第一附属医院，西安市中心医院，延安大学附属医院，渭南市中心医院，安康市中心医院，宝鸡市中心医院，汉中3201医院)就诊的2827例HCV患者作为研究对象，所有患者均符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中HCV相关诊断标准且分型前未接受过抗病毒相关治疗，排除因其他病毒所致的肝炎及酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等其他导致肝脏病变的疾病。收集所有患者的临床资料，包括性别、年龄、居住地区等。其中，男性1639 例，女性1188 例；年龄17～75 岁，平均(46.35±14.38)岁；陕北地区(榆林、延安)298 例，陕南地区(汉中、安康)213 例，关中地区(西安、宝鸡、渭南)2316 例。

1.2 方法

1.2.1 血清标本采集 于晨间抽取两组患者入院时的静脉血10 mL，置于室温下静置24 h，离心后取阳性血清1.0 mL用Eppendor离心管分装，-70℃保存标本。

1.2.2 HCV基因型检测 采用PCR-荧光探针法进行HCV基因型检测，试剂盒购自泰普生物科学有限公司，所有操作均严格遵循试剂盒说明书。PCR-RDB分子杂交提取HCV 基因分型RNA 的方法：①取已灭菌离心管，依次加入50 μL RNA 蛋白酶K、200 μL 血清、200 μL 裂解液。②摇荡均匀后，通过离心泵高速离心10 s，放于72℃环境中静置10 min。③在其中加入250 μL 无水乙醇，使其充分融合在一起，再将其转入离心柱中。以12000 r/min离心1 min后，除去离心液。④在离心柱中加入500 μL抑制去除液，以12000 r/min离心1 min，然后加入500 μL去离子液，以12000 r/min离心1 min，再重复一次，最后将离心柱移入新的收集试管中。⑤将离心柱以14000 r/min 离心3 min 以除去残余乙醇。⑥将离心柱移入新的无菌离心管中，放于72℃环境中静置2 min，再加入已预热的50 μL洗脱液，室温下静置1 min，再以14000 r/min 离心1 min。⑦在试管中加入30 μL 提取的病毒核酸，按PCR 反应条件进行扩增：第一次为：94℃5 min，然后再以以下方式进行循环：94℃40 s；50℃40 s；72℃40 s，30个循环；第二次为：94℃5 min，按以下方式循环：94℃40 s；54℃40 s；72℃40 s，30个循环。所有检测孔均设置为FAM 和HEX，荧光信号收集：60℃45 s；反应结束后，根据分析后图像调节Baseline 的Start 值，End 值以及Threshold 值，点击Analysis 自动获取分析结果，在Report界面查看结果。

1.3 观察指标 采用PCR-荧光探针法检测HCV 基因型分型，对比不同地区、不同性别患者间的HCV基因型分布情况。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS17.0 统计软件进行分析。计数资料的统计描述采用百分率表示，多个样本率间的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因分型结果 本组2827例HCV感染者中，有2595 例成功分型，检出率为91.79%。其中1b 型1049 例，占37.11%；2a型1241例，占43.90%；1a型25例，占0.88%；2b型13例，占0.46%；3a 型181例，占6.4%；3b型50 例，占1.77%；6a 型36例，占1.27%，见图1。

图1 陕西省HCV基因型分布

2.2 陕西省三大地区HCV基因分型特征 关中和陕北地区，以2a 型为主，分别占43.36%和47.99%，而陕南以1b 型为主，占52.11%，三个地区的基因型分布比较差异具有统计学意义(χ2=119.4，P＜0.05)；两两比较发现，陕南与关中、陕北与关中、陕南与陕北之间的基因型分布差异均具有统计学意义(χ2=54.355，62.274，36.976；P＜0.05)，见表1和图2。

表1 陕南、陕北、关中地区HCV基因型分布比较(例)

图2 陕西省陕南、关中、陕北地区HCV基因分型分布

2.3 性别与HCV基因型的关系 纳入的丙肝男性患者中2a 型比例最高(40%)，其次是1b 型(39%)和3a型(15%)；女性患者中2a型和1b型比例相同(46%)，其次是3a型(4%)。2a、1b型在不同性别组间比较差异均无统计学意义(χ2=0.734，1.003；P＞0.05)，3a型在不同性别组间比较差异有统计学意义(χ2=7.037；P＜0.05)，见图3。

图3 不同基因型的性别比较

3 讨论

HCV 是一种流行于全球的RNA 病毒，据世界卫生组织统计，全球约有1.7亿的人口感染慢性HCV[1]。由于HCV的高遗传变异性，目前HCV表现为7种基因型和100多种亚型，国际上通常采用阿拉伯数字(1～7)代表基因型，英文小写字母代表基因亚型(如1a、1b等)。研究显示，不同基因型或亚型感染的地理分布存在差异。1，2，3 型于全球最高，其中1 型约有8340 万患者(46.2%)，几乎占所有感染者的一半，且超过1/3的患者位于东亚；其次是3 型约有5430 万感染者(30.1%)，且3/4的患者分布于南亚，据伊朗权威数据显示，在伊朗地区，基因3 型为主要基因型，占90.3%左右[2]；2、4和6型感染者分别为1650万(9.1%)，1500万(8.3%)和980万(5.4%)，2型和6型病例于东亚最多，而北非和中东的4 型病例较多；有研究显示5 型可能是全球最少的HCV 基因型，大约140 万人感染，大部分发生在南部和东部撒哈拉以南的非洲；迄今为止，7型是从一名居住于加拿大的中非移民体内分离出来的，仅有此一例[3]。近些年研究发现，长期的慢性丙型病毒性肝炎与肝硬化、原发性肝癌甚至肝衰竭密切相关[4]，而HCV基因型与抗病毒药物的疗效密切相关，如1a、1b 型易发生严重肝脏疾病以及对干扰素治疗的低反应，且1b 型患者患肝细胞癌的风险更大[5]。因此，探讨HCV基因分型的地域性分布特征对于明确HCV病毒的演变及基因分型的转化、制订合理有效的诊疗方案具有重要的研究价值和意义。

我国是一个幅员辽阔，人口众多的国家，丙肝的分布同全球略有不同。庄辉院士对我国各省慢性丙肝感染人群采取分层抽样的方法调查后，显示1b型为我国最主要基因型(56.8%)，但因我国地域广阔，不同地区间差异较大[6]。其次为2a型。我国南方和北方的基因型分布也不相同，且基因型3a型、3b型、6a型正逐渐增加，同时1b型和2a型正处于降低趋势[7]。一项纳入29个省市自治区的32030例HCV感染者大样本调查研究同样发现1b(52.18%)、2a(28.69%)为我国最主要的基因型[8]。在我国北方地区HCV 基因型比较单一，以1b 和2a 为主；南方地区的HCV 基因型种类较多，以1b型为主，其次为2a、3a、3b，各型均占有较大比例。但一些地区基因型分布较特殊，例如云南省以3b型为主、香港以6a型为主。近几年，由于受流动人口、涉毒人员增加、经济全球化、人员流动频繁等因素影响，使得原有基因型分布状况发生改变，例如，由于社会经济的发展和人口流动的增加等因素，6a型已经取代了2a型，成为广东第二大丙肝基因型[9-10]。

本研究是目前样本量最大的关于陕西省HCV 基因型分析，所研究结果为我省慢性丙肝患者进行个体化抗病毒治疗、经济且有效预防HCV传播具有重要意义。本研究采用大样本调查研究的方式，在陕西省三大地区(陕南、陕北、关中)的地区级中心医院，收集了共2827例HCV感染者血清，结果显示陕西省丙肝基因分型以2a型(43.90%)为主，其次依次为1b型(37.11%)，3a型(6.40%)，3b型(1.77%)。本研究显示，陕南、陕北及关中病毒基因型并不完全一致，陕南以1b型为主，因地理位置、生活习惯等不同，对HCV 感染及传播途径也不尽相同。由于秦岭这一天然分界线的存在，陕南地理位置更接近于四川，基因分型也更接近于四川[11-12]。本研究显示陕北和关中均以2a型为主，2a型在我国丙肝基因型中仅次于1b型，而在陕西地区则排第一。在我国，2a型始于1979年，在此之前集中在西北地区，可能与毒品沿古代丝绸之路从西方和中亚运输到我国有关。并且我国西北部的2a型菌株和日本菌株很接近，提示2a型可能是流行于中国北部地区，特别是我省的原因之一[13]。基因型3a和3b在静脉吸毒者中非常常见，主要在欧洲，美国和东南亚地区，我国主要集中在我国西南地区(云南、贵州、四川)和东部地区，尤其是静脉吸毒的艾滋病患者，甚至高于1b型[14]。本研究显示3a基因型在我省占有一定比例，考虑与邻近国家(如阿富汗、阿塞拜疆、乌兹别克斯坦、白俄罗斯等)通过贩运毒品传播到中国以及与经济发展导致的人口流动性增加有关。

研究显示，丙肝基因型分布可能与性别有关，在利比亚人群中，基因1 型中男性比例较高，而4 型则多发生于女性[15]；而在希腊的一项研究中显示，1 型在老年人和女性中更常见，3 型在年轻人和男性中较常见[16]。此外，丙肝基因型分布在很大程度上受传播途径的影响，例如在年轻男性中，通过注射吸毒进行持续传播显示出较高的患病率，而在受感染人群年龄较大的国家中，则是通过母婴传播和不安全血液制品的使用等途径传播[17]。Christer 在一项静脉吸毒人群中研究性别对HCV 感染的影响中指出，在纳入的310 例静脉吸毒人群中，268 例吸毒人员HCV 抗体阳性(86.5%)，其中207例可以检测出HCV-RNA。1型和3 型基因分别占35.9%和33%，女性在HCV 感染中更容易自发性的恢复，可能导致相对性的男性吸毒人员HCV比例的升高[18]。在我国多个地区，均有研究显示在吸毒人群中，男性所占比例明显高于女性。本研究结果显示，女性丙肝患者以2a，1b型为主，男性患者最多的2a型，其次是1b型和3a型，且男性3a型比例明显高于女性，考虑与通过贩运毒品传播到中国，且吸毒人员中，男性所占比重较大有关。

本研究结果显示陕西省的HCV 基因型的分布特征不同于省外其他地区，主要以2a 型、1b 型、3a 型为主，且3a 型基因型分布可能与性别有关，这将有助于了解陕西省不同地理区域丙型病毒性肝炎的流行病学趋势，为疾病防控部门提供依据，也将为临床工作者制订更加合理且有针对性的诊疗方案和药物的合理选择提供帮助。