一种龟甲抗肝癌药理作用机制的网络药理学研究

左蕴泽,王 卓，周厚江，赵伟岸，南海军*

(1.广东药科大学，广东 广州 510006; 2.MRC Protein Phosphorylation & Ubiquitylation Unit University of Dundee United Kingdom；3.云浮市云安区完璧金钱龟养殖有限公司，广东 云浮 527527)

龟甲，是龟科动物乌龟(Testudinis cabapacis et plastri colia)经剥取除去腐肉，晒干得到的背甲或腹甲，主产地在浙江、湖北、江苏等省份。基于龟甲所制得的各类龟甲胶在历版 《中国药典》 均有收载，最开始记载于《本草崇源》一书，属胶剂甲胶一类。中医认为龟甲胶性凉，味咸、甘，归肝、肾、心三经，功效滋阴潜阳[1-2]、养血止血，用于阴虚血亏[2]，主治阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄、崩漏带下等证。除此外，现代药理研究表明龟甲胶还有抑制肿瘤、调节代谢、提高免疫、延缓衰老等功效[3]。在当下日益注重个人健康的时代，龟甲胶因能够很好地改善人体阴虚亏损等健康状态，成为继燕窝、冬虫夏草等之后，当前中高端滋补药材市场的主要产品。近年来，人们日益重视对于龟甲胶的炮制加工、制备工艺、有效化学成分分析、临床药理学等的研究[4]，龟甲胶制备工艺作为其中重要一环，也越来越得到深入的研究和探讨[5]。本研究采用网络药理学的方法对龟甲的潜在作用成分-靶点-通路进行多层次考察，发现其对改善肝癌患者的术后康复及提高机体自身免疫力具有一定优势。龟甲作为胶类药食同源药材之一，其保健功能或在癌症辅助营养支持康复方面具有较大的开发前景。研究通过使用网络药理学的方法挖掘龟甲潜在的保健功能，为其在功能性食品及辅助营养支持方面提供理论参考依据。为龟甲胶后续开发研究提供一定实验依据。

1 材料与方法

为了进一步考察龟板的潜在药理活性，本研究使用BATMAN-TCM[6]数据库对龟板的成分及对应的成分靶点进行预测，设置条件为Score_cutoff≥20，Adjusted P-value cutoff≤0.05。同时，检索NCBI数据库，获得肝癌靶点，使用在线jvenn[7]工具获得成分与肝癌的共同靶点，之后对其GO功能注释及KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 龟甲化合物及其潜在作用靶点

根据Score_cutoff≥20，Adjusted P-value cutoff≤0.05条件进行筛选，获得龟板成分有天冬氨酸、苏氨酸、碳酸钙、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等，化合对应的成分靶点有283个，使用cytoscape3.7.1构建成分-靶点网络图，见图1。通过分析网络图可知，龟板中存在多种氨基酸，同时可以对各靶点进行调控，形成了复杂的生物学网络。

图1 龟甲成分-靶点网络

2.2 龟甲与肝癌共同靶点

以liver cancer AND Homo sapiens为关键词，检索NCBI数据库，选择来源OMIM数据库，获得471个靶点。经jvenn工具分析获得11个共同靶点，分别为：PTGS2、CPQ、PTK2、GLUL、MTR、GNMT、TNF、ABCB4、GATA3、FOS、JUN，见图2。

图2 龟板成分靶点-肝癌共同靶点

2.3 共同靶点GO富集分析

使用DAVID 6.8数据库对共同靶点进行GO富集分析，根据P值对细胞组成(Cellular Component，CC)、生物过程(Biological Process，BP)与分子功能(Molecular Function，MF)三个方面进行排序，其前4富集条目见表1、图3。分析结果可知，这些靶点主要涉及了蛋白激酶B信号转导的正调控、转化生长因子β受体信号通路调控、转录因子复合体、转录调控区DNA结合、内质网调控等，这表明龟板可能通过作用于共同靶点，从而直接或间接调控这些生物学功能来改善肝癌症状。

表1 共同靶点部分GO富集结果

图3 GO富集柱状图

2.4 共同靶点KEGG通路富集分析

共同靶点通过使用ClueGO插件进行KEGG通路分析可知，这些靶点显著富集于IL-17信号通路、肝细胞生长因子受体的信号转导、NF-κB信号通路、TGF-β受体信号传导、炎症性肠病信号通路等。

3 讨论

肝癌是临床一种较为常见的恶性肿瘤之一，其发病较为隐匿，部分患者得到确诊时已处于中晚期，生存预后较差。美国癌症协会统计表明，2007-2016年期间，肝癌发病率仍以2%到3%速度逐年增长，其5年生存率约为18%[8]。中国癌症统计数据显示，肝癌发病率约46%，死亡率约42%，是癌症死亡原因之一，严重威胁人类健康及生命安全[9]。目前肝癌常采用多种手段进行综合治疗，如手术切除、放化疗、免疫治疗、中药治疗等。虽然手术治疗、放化疗在一定的程度上可以减缓肝癌的进展，但是其副作用大，机体容易出现耐受性，长期疗效及术后康复仍不容乐观。

图4 KEGG富集功能网络图

祖国医学在治疗肝癌方面具有独特的疗效，它可以依据肝癌患者的个体差异进行辨症施治，在治癌的同时兼顾人体的正气。现代药理研究表明，中医药对阻滞肝癌细胞周期、抑制肿瘤血管生成、信号通路调节等方面起到很大帮助[10]。而龟甲作为药食同源胶类药材之一，富含多种氨基酸，可以调节免疫系统、促进巨噬细胞吞噬能力[11]，在一定程度上可以加快肝癌患者的术后恢复及减轻放化疗药物的损伤，具有较好的开发前景。本研究使用网络药理学的方法预测得到了龟甲含有天冬氨酸、苏氨酸、碳酸钙、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等成分。叶超平等[12]发现肝癌患者因肝合成功能降低、肝癌细胞分差化、肿瘤破坏肝细胞而导致其补体C3水平显著下降，患者体液免疫机制也因此受到限制。Pan 等[13]发现蛋氨酸羟基类似物可以增加补体C3含量，同时还能下调促炎因子及上调抗炎因子的表达，增强免疫器官的免疫功能。苏氨酸属于限制性氨基酸，参与机体免疫的调控，当体内不足或缺乏时会抑制免疫球蛋白、T与B淋巴细胞的产生。现代药理研究表明，苏氨酸、天冬氨酸、亮氨酸等缺乏均可以使动物胸腺、脾脏萎缩，进而出现免疫缺陷[14-]。这提示龟甲抗肝癌作用可能是通过氨基酸补充来恢复机体免疫功能以抑制癌症细胞的增殖、侵袭等。中医肝癌终末期肝肾阴虚性患者，由于津液亏虚、正气不足，肝脏储备功能较差，CD4、CD19及NK细胞值下降[156]。而龟甲为血肉有情之品，禀脾肺肾三阴之气，大补真阴，破症瘕，可通过多种氨基酸刺激机体的免疫功能来达到改善肝癌的津液亏虚、免疫低下等功效。

通过对龟甲成分靶点及肝癌靶点进行取交集获得PTGS2、GATA3、PTK2、TNF等靶点。前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2)，又称环氧合酶2(COX2)，是前列腺素生物合成中的关键酶，既是一种双加氧酶又是一种过氧化物酶。许雅苹等[17]发现肝星状细胞 (HSC)可以调控COX2来抑制CD8、CD4免疫细胞，进而改变机体的免疫机能，调节肿瘤生长的微环境来影响肿瘤的进展。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种重要的促炎因子，可以调节NF-κB信号通路、促进T细胞及其他杀伤细胞及调节机体免疫功能影响着肿瘤的发生发展[18]。研究表明，老年肝癌肝切除术患者给予肠内营养支持可以降低TNF-α水平，降低体内炎症反应，同时还能改善术后免疫抑制状态，促进患者的肝功能恢复等[19]。Fan等[20]发现蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)可以通过激活Wnt/β-catenin信号通过促进肝细胞癌(HCC)的肿瘤发生、复发、耐药等，与肝癌总生存率及无复发生存率相关。Lin等[21]通过对肝癌患者外周血进行检测，发现细胞转录因子GATA3基因表达水平显著高于对照组，其过表达与Th1/Th2比例失衡相关。研究发现，GATA3基因是KIAA1429介导的m6A修饰的直接下游靶点，与肝癌患者的生存预后、肿瘤的生长与转移有密切联系[22]。根据本研究可推测出龟甲中成分可能是通过介导这些靶点直接或间接来改善肝癌患者的术后康复或增强机体自身免疫来抑制肿瘤细胞的增殖。

通过对共同靶点进行功能注释分析及通路分析发现，这些靶点显著富集于蛋白激酶B信号转导的正调控、转化生长因子β受体信号通路调控、转录因子复合体、转录调控区DNA结合等，作用通路主要为IL-17信号通路、肝细胞生长因子受体的信号转导、NF-κB信号通路、TGF-β受体信号传导、炎症性肠病信号通路。现有研究表明，这些通路可对肝癌细胞增殖、分化、迁移和凋亡、肿瘤血管生成、自噬、机体免疫等进行调控[23-27]。

综上可知，本研究通过网络药理学的方法对龟甲的潜在作用成分-靶点-通路进行多层次考察发现其对改善肝癌患者的术后康复及提高机体自身免疫力方面具有一定优势。龟甲作为胶类药食同源药材之一，其保健功能或在癌症辅助营养支持康复方面具有较大的开发前景。本研究通过使用网络药理学的方法旨在挖掘龟甲潜在的保健功能，为其在功能性食品及辅助营养支持方面提供理论参考依据。