决明农艺性状与其种子中蒽醌类物质含量之间的相关性分析

徐世浩，孟凡旭，赵宏光，徐波，张学敏，刘景玲，梁宗锁，4，5*

（1.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌712100；2.陕西天士力植物药业股份有限公司，陕西 商洛726000；3.天津天士力现代中药资源有限公司，天津300410；4.天津市现代中药资源研究企业重点实验室，天津300410；5.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江 杭州3100384）

决明子为中医药临床中常使用的原料之一，是豆科植物决明（Cassia obtrusively L.）或者小决明（Cassia tera L.）的干燥成熟种子，其味苦，性微寒，可润肠通便，降脂明目［1，2］。决明种子的药用成分主要是橙黄决明素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等蒽醌类物质［3，4］。在我国决明的种植范围广，但不同产地的决明种子中蒽醌类物质含量差异较大［5］，且市售决明种子中蒽醌类物质含量不能满足生产的需要，因而培育有效成分含量高的决明新品种显得格外重要。太空诱变技术与普通诱变处理相比具有变异率高、周期短的特点［6］，因而成为选育决明优良品种的重要技术手段。农艺性状与植物内在的生理生化特征息息相关且便于观察测量，是植物种质资源评价的重要措施之一［7］。本试验以太空诱变技术处理的决明种子为材料，基于农艺性状及其种子中蒽醌类物质含量等指标，探讨决明主要农艺性状与其种子中蒽醌类物质含量之间的关系，以期为进一步筛选优良品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

决明种子由商洛天士力植物药业有限公司提供，经浙江理工大学鉴定为决明种子。将决明种子分为两份，一份进行太空搭载试验（SP），一份留作地面对照（CK）。经过7 代的田间培育，得到4份优质种子，分别 记为Y3、Y4、Y5、Y6，与对照（CK）一同于2019 年4 月初种植于陕西省商洛市天 士 力 药源 基 地（北 纬33°51′38.42″东 经109°53′31.56″）［8］。行距60 cm，株距45 cm，田间管理参照尚文艳等［9］和詹杰等［10］的方法。

1.2 仪器与试剂

主要仪器：Waters2996 高效液相色谱仪、Empower2 色谱工作站、Waters PAD 检 测器、Waters Sunfire c18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、超声提取器、恒温水浴锅、优普超纯水机。主要试剂：色谱级甲醇、乙醇、乙腈、磷酸，购自西安试剂厂；橙黄决明素（6797925-3，纯度99.3%）、大黄酚（481-74-3，纯度98.83%）、芦荟大黄素（481-72-1，纯度98.43%）、大黄素甲醚（521-61-9，纯度99.5%）等标准品购自北京世纪奥科生物技术有限公司；硫酸、浓盐酸、三氯甲烷、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯等分析纯试剂购自三力化玻站。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 农艺性状指标的测定

2019 年9 月底，分别在每个决明品系中随机取10 株进行各项指标的测定。测定指标包括株高（地面至植株顶端的绝对高度）、茎粗（距地面5 cm处，南北向及东西向直径测量3 次后取平均值）、分枝数（从基部开始生于主茎四周的分枝数量）、冠幅（用钢尺测量植株东西向、南北向两个维度长度，测量3 次，取平均值）、叶面积（用叶面积仪测量同一部位10 片叶子取平均值）、结荚数（对长度大于5 cm 的荚果进行计数）、鲜质量（整株连根拔起，去掉泥土立即称重）、干质量（各株在同一条件下晾干至恒重后称重）、种子千粒质量（随机数出3 个一千粒种子，分别称重，求其平均值）及含水量（干燥前供检种子质量减去干燥后供检种子质量的差值占干燥前供检种子质量百分比）等。

1.3.2 决明种子中4 种蒽醌类物质含量测定

样品溶液制备参照《中华人民共和国药典》（2015 版一部）［11］中决明种子中有效成分提取的方法进行。参照孟凡旭［12］的实验条件并做部分修改后，测量决明种子中橙黄决明素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等4 种蒽醌类物质含量。色谱条件为：色谱柱Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，进样量10 μL。以乙腈为流动相A，以体积分数0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～15 min，40%A；15～30 min，40%～90%A；30～45 min，90%A）。检测波长284 nm。

1.4 数据分析

试验数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS20.0 对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 决明主要农艺性状指标及蒽醌类物质含量多重比较

不同品系决明的各项农艺性状指标及蒽醌类物质含量均存在不同程度的差异（表1）。Y5 单株株高、分枝数、叶面积、结荚数、鲜质量、干质量、种子千粒质量、种子含水量均值最大，其中Y5 的株高、结荚数、种子千粒质量显著高于其它品系及对照，说明Y5 的多数农艺性状指标表现较为突出，且具有株型高、结荚多、种子千粒质量高的特点；Y6 单株茎粗、冠幅均值最大，其中Y6 的冠幅显著高于其他品系及对照，说明Y6 具有大冠幅的特点；在四种蒽醌类物质含量方面，诱变品系的橙黄决明素含量、芦荟大黄素含量、大黄素甲醚含量均显著高于对照组，Y3、Y5 的大黄酚含量显著高于Y4、Y6 及对照组，其中Y3 的橙黄决明素含量、大黄酚含量最高，Y6 的大黄素甲醚含量、芦荟大黄素含量最高，说明Y3、Y6 在蒽醌类物质含量上具有优势。

2.2 决明主要农艺性状指标及种子中4 种蒽醌类物质含量的变异系数分析

诱变后决明的农艺性状及4 种蒽醌类物质含量出现了较大的变异（表2），变异系数由大到小依次为芦荟大黄素含量＞大黄酚含量＞橙黄决明素含量＞茎粗＞分枝数＞结荚数＞叶面积＞大黄素甲醚＞冠幅＞鲜质量＞株高＞干质量＞千粒质量＞种子含水量。可以看出，决明的冠幅、鲜质量、干质量、株高、千粒质量、种子含水量变异系数均低于10%，芦荟大黄素含量、大黄酚含量的变异系数均较大，接近30%，而橙黄决明素含量、茎粗、分枝数、结荚数、叶面积、大黄素甲醚含量的变异系数介于两者之间，表明供试材料的多项指标均出现了丰富的变异，其中以大黄酚、芦荟大黄素含量这两项指标的变异最为丰富。

2.3 决明主要农艺性状指标及其与种子中蒽醌类物质含量相关性分析

决明主要农艺性状及其与种子中蒽醌类物质含量的相关性分析（表3）表明：相关性分析中共有44 对指标极显著相关，16 对指标显著相关。其中鲜质量与橙黄决明素含量呈极显著正相关，株高、干质量、种子含水量与橙黄决明素含量呈显著正相关；冠幅与大黄酚含量呈极显著负相关，鲜质量与大黄酚含量呈显著正相关；芦荟大黄素含量与株高、冠幅、分枝、叶面积、结荚数、鲜质量、橙黄决明素含量呈极显著正相关，与大黄酚含量呈极显著负相关，与茎粗、鲜质量、种子含水量呈显著正相关；冠幅与大黄素甲醚含量呈极显著正相关，分枝数、叶面积、鲜质量、干质量与大黄素甲醚含量呈显著正相关；4 种蒽醌类物质之间有一定的制约关系，橙黄决明素含量与芦荟大黄素含量、大黄素甲醚含量程极显著正相关；大黄酚与芦荟大黄素含量、大黄素甲醚含量呈极显著负相关；大黄素甲醚含量与橙黄决明素含量、芦荟大黄素含量呈极显著正相关。可以看出，鲜质量高的材料其种子中4 种蒽醌类物质含量一般较高；冠幅较大的材料，其大黄酚含量一般较低；橙黄决明素含量高的材料，其芦荟大黄素含量、大黄素甲醚含量较高，但大黄酚含量的提高可能会导致芦荟大黄素含量的明显降低。

表1 决明主要农艺性状及4 种蒽醌类成分含量多重比较Table 1 Multiple comparisons of the main agronomic traits of Cassia obtrusively L.and the contents of four anthraquinones

表2 决明主要农艺性状及四种蒽醌类成分含量的变异系数分析Table 2 Analysis of variation coefficients of main agronomic characters of Cassia obtrusively L.and contents of four anthraquinones

表3 决明主要农艺性状及其与种子中4 种蒽醌类成分含量的相关性分析Table 3 Correlation analysis of the main agronomic characters of Cassia obtrusively L.and the content of four anthraquinones

2.4 决明主要农艺性状指标及4 种蒽醌类成分含量的主成分分析

为了更充分的反映出决明的各项指标中起主导作用综合指标，对决明的主要农艺性状指标和种子中4 种蒽醌类成分含量进行主成分分析。结果（表4）表明，前4 个主成分的累积贡献率为82.609%，说明前4 个主成分已基本包含了决明性状的全部信息，可用前4 个成分对其进行综合评价。

第一主成分的特征值是5.684，贡献率为40.598%，决定第一主成分的指标主要是茎粗、冠幅、分枝数、叶面积，其载荷值均为正值，可作为表型因子。但株高、鲜质量、千粒质量、种子含水量、橙黄决明素含量、大黄酚含量、大黄素甲醚含量等的特征向量为负，因此追求粗茎、大冠幅、多分枝数、大叶面积等指标不利于蒽醌类含量的提高。因此，第一主成分偏低较好。

第二主成分的特征值为2.499，贡献率为17.85%，决定第二主成分的主要指标是种子的千粒质量和含水量，可作为种子因子；其对应亲本的千粒质量大、种子含水量高、株高较高、橙黄决明素含量及大黄酚含量较高。因此在选育橙黄决明素、大黄酚含量高的决明品系时，第二主成分应适中偏高。

第三主成分特征值是2.107，贡献率为15.047%，第三主成分指标主要是橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素甲醚，可作成分因子；其对应亲本的橙黄决明素含量、芦荟大黄素含量、大黄素甲醚含量较高，大黄酚含量较低，但以橙黄决明素含量、大黄酚含量为评价指标，第三主成分应适中。

第四主成分特征值是1.276，贡献率为9.114%，对应的特征向量从大到小依次为：干质量、鲜质量、大黄酚含量、分枝数、茎粗，因此称第四主成分为质量因子。其对应亲本的茎粗较粗、分枝数较多、大黄酚含量较高、干质量及鲜质量较大，有利于提高产量及大黄酚含量，因此第四主成分应偏大。

表4 决明主要农艺性状及4 种蒽醌类成分含量的主成分分析Table 4 Principal component analysis of the main agronomic characters of Cassia obtrusively L.and the content of four anthraquinones

3 讨论与结论

本研究表明，经过太空搭载的决明后代中出现了丰富的变异，除Y3 的茎粗、冠幅，Y6 的千粒质量、大黄酚含量低于对照外，各品系指标均高于对照，且株高、分枝数、橙黄决明素含量、芦荟大黄素含量、大黄素甲醚含量、种子含水量均表现为航天诱变品系显著高于对照，且不同品系之间也存在差异。相关研究结果表明太空搭载能够显著提高植物后代的变异率，从而提供丰富的育种材料，是品种选育重要措施之一［13～18］。丰富的变异材料将有助于新品种的选育，而航空诱变为决明新品系的选育提供丰富的育种材料，这将加快决明新品种选育的进程。

通过对5 批决明的主要农艺性状及种子中4种蒽醌类物质含量进行变异系数分析发现，变异系数最大的是芦荟大黄素含量、大黄酚含量，其变异系数均接近30%；茎粗、分枝数、叶面积、结荚数、橙黄决明素含量、大黄素甲醚含量的变异系数较高，在13%左右。在育种研究中，变异系数是衡量资料中观测值变异范围及变异程度的量，变异系数越大，表明遗传多样性越丰富，选择的潜力更大［7，19，20］。因此经过太空搭载后，决明品系出现丰富的遗传多样性，有利于从中筛选蒽醌类物质含量高的决明新品系。

相关性分析表明：决明鲜质量与橙黄决明素含量呈极显著正相关，株高、干质量、种子含水量与橙黄决明素含量呈显著正相关；冠幅与大黄酚含量呈极显著负相关，鲜质量与大黄酚含量呈显著正相关；4 种有效成分之间，芦荟大黄素含量与橙黄决明素含量呈极显著正相关；大黄素甲醚与橙黄决明素、芦荟大黄素呈极显著正相关，大黄酚与芦荟大黄素含量呈极显著负相关。章明敏［21］、李金金等［22］研究认为株高与橙黄决明素含量存在显著正相关关系，与本研究结论一致。曹丽娟等［23］认为仅以橙黄决明素、大黄酚含量作为评价指标不能充分反映决明种子质量，因此本研究增加了芦荟大黄素、大黄素甲醚含量的测定，补充了章明敏［21］、李金金等［22］研究中的不足，并从中发现了影响蒽醌类物质含量的多项指标及4 种蒽醌类物质之间可能存在的制约关系，这将有助于推进决明新品种的选育，但该规律是否适用于其他产地的普通决明还有待进一步的研究。

主成分分析能够对多组数据进行降维处理，是一种有效的综合评价方法，在中药质量评价等诸多方面有着广泛的应用［24～26］。在新品种选育过程中，由于性状指标多、待选群体大且各项指标间存在着许多有利和不利的相关性，如果仅仅依靠表型直观评选，就会增加误判的概率，也将影响育种工作的进展。通过主成分分析，能够将决明的14 项指标转化为较少的几个主成分。由于这4 个主成分提供了原性状82.609%的信息，且是综合的、相对独立的指标体系，因此将主成分分析用于决明农各项指标的评价和筛选，既能体现其综合表现，又能降低选育难度，且具有科学性。本研究结果表明，为筛选出表现优良的决明新品系，应按照第一主成分应偏低、第二主成分适中偏高、第三主成分适中、第四主成分偏大的标准进行选育。

培育优良品种是我国药用植物栽培的先决条件［27］，农艺性状的筛选是优良品种的选育过程中最直观的手段，其中成分含量往往是中药材育种中必然要考虑的因素［28］。本研究通过多重比较及变异系数分析发现，航天诱变使决明不同品系的出现差异，且以芦荟大黄素、大黄酚的变异最为丰富，这将为解决决明种子中蒽醌类物质含量不足的难题提供了可能。本研究通过相关性分析找到了与决明种子中蒽醌类物质含量相关的性状指标，又进一步通过主成分分析将决明的各项指标转化为较少的几个主成分，这将为决明的良种选育提供有益的参考，并将进一步加快育种进程。

本研究通表明：航天诱变的决明各性状间存在丰富的变异，增加了决明的遗传多样性，使针对性的育种成为可能；利用相关性分析、主成分分析的方法可以按照育种要求对各指标、各主成分进行单独选择，为后期筛选高蒽醌类物质含量的决明新品种提供理论依据。

本研究对诱变决明的农艺性状及有效成分含量进行了初步的分析，为后续的优良品系选用提供了一定的参考，但对于诱变材料在基因层面的变异还未进行深入研究，有待后续基因层面的挖掘将进一步加快优质品系的选育。