酶重量法-液相色谱法测定食品中总膳食纤维

余枭然 余慧剑

摘 要：本研究利用酶重量法-液相色谱法，测定含水溶性膳食纤维食品的总膳食纤维含量。采用酶重量法测定试样中不溶性膳食纤维（Insoluble Dietary Fiber，IDF）和高分子质量可溶性膳食纤维（Soluble Dietary Fiber，SDF）的含量，采用液相色谱法测定试样的低分子质量抗性麦芽糊精（Resistant Malto Dextrin，RMD）含量。液相色谱法的方法检出限为0.142%，定量限为0.474%，线性方程为y=1.207x+0.030，相关系数R2为0.999，加标回收率为96.6%～99.7%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为1.53%～1.69%（次数n=6）。精密度试验以酶重量法-液相色谱法测试样品6份，平均含量为65.78%，RSD为0.52%。实验结果表明，该方法灵敏度、准确率高，适用于添加抗性淀粉、含低分子质量的抗性糊精等水溶性膳食纤维的食品中总膳食纤维的测定。

关键词：酶重量法-液相色谱法;膳食纤维;抗性糊精

中图分类号：R151.3 文献标识码：A 文章编号：1003-5168（2021）28-0-04

Abstract： In this study， the enzyme gravimetric method-liquid chromatography is used to determine the total dietary fiber content of foods containing water-soluble dietary fiber. Meanwhile， the enzymatic gravimetric method is used to determine the content of Insoluble Dietary Fiber （IDF） and high molecular weight Soluble Dietary Fiber （SDF） in the sample， and the low-molecular-weight Resistant Malto Dextrin （RMD） content of the sample is determined by liquid chromatography. The detection limit of liquid chromatography method is 0.142%， the limit of quantification is 0.474%， the linear equation is y=1.207x+0.030， the correlation coefficient R2 is 0.999， the recovery rate of standard addition is 96.6%～99.7%， and the Relative Standard Deviation （RSD） is 1.53% ～1.69% （number of times n=6）. In the precision test， 6 samples are tested by enzyme gravimetric method-liquid chromatography， with an average content of 65.78% and an RSD of 0.52%. The test results show that the method has high sensitivity and accuracy， and is suitable for the determination of total dietary fiber in foods containing water-soluble dietary fiber such as resistant starch and low-molecular-weight resistant dextrin.

Keywords： enzyme gravimetric method-liquid chromatography;dietary fiber;resistant dextrin

随着人们生活水平的提高和饮食的日益精细化，心脑血管病、糖尿病、肠道癌及便秘等现代“富贵病”的患病率大幅上升。与此同时，我国人口快速进入老龄化，人们的食品消费观念也发生了变化，不再仅仅停留在食品的感官、风味与口感上，而越来越注重食品的健康功能性。膳食纤维（Dietary Fiber，DF）是一种重要的功能性食品成分，其突出的润肠通便、调节血糖反应、降血脂和减肥等功能正逐渐被人们所认识，已成为国际上广泛流行的功能性健康食品配料，被称为继食用糖、蛋白质、脂肪、水、矿物质和维生素之后的“第七大营养素”[1-4]。

近年来，国内市场膳食纤维类功能性食品已成为开发的热点，故研究稳定可靠的膳食纤维含量测定方法是保证产品质量稳定的迫切要求。目前，测定膳食纤维的方法有酶重量法和酶重量法-液相色谱法[5-8]。酶重量法主要适用于谷类、蔬菜、水果及其制品中总膳食纤维、可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维的测定，但并不适用于含低分子质量抗性麦芽糊精、寡果糖、低聚半乳糖、多聚葡萄糖和抗性淀粉等水溶性膳食纤维食品中总膳食纤维的测定[9-12]。笔者采用酶重量法-液相色谱法测定以抗性糊精和抗性淀粉为主要原料制得的复合纤维素产品中的总膳食纤维含量，对液相色谱法进行了方法学研究，获得了满意的测定结果。

1 试验部分

1.1 仪器及试剂

主要仪器如下：示差折光检测器（Refractive Index Detector，RID）型高效液相色谱仪、凝胶保护柱（6.0 mm×40.0 mm，6 μm）、凝胶色谱柱（7.8 mm×300.0 mm，6 μm，2根）、高型无导流口烧杯（400 mL或600 mL）、坩埚、真空过滤装置、恒温振荡水浴箱（室温5～100 ℃，温度波动±1 ℃）、分析天平（感量0.1 mg）、马弗炉（525 ℃±5 ℃）、烘箱（105 ℃，130 ℃±3 ℃）、干燥器、pH计、真空干燥箱、冷冻干燥箱、筛网（50目）、旋轉蒸发仪。

主要试剂如下：95%乙醇、丙酮、石油醚、氢氧化钠、重铬酸钾、三羟甲基氨基甲烷、2-（N-吗啉代）乙烷磺酸、冰乙酸、盐酸、热稳定α-淀粉酶液、蛋白酶、硅藻土、溴甲酚绿、右旋葡萄糖、麦芽糊精、85%乙醇溶液、78%乙醇溶液、0.05 mol/L MES-TRIS缓冲液、蛋白酶溶液、酸洗硅藻土、重铬酸钾洗液、3 mol/L乙酸溶液、0.4 g/L溴甲酚绿溶液、多氨基弱碱性离子交换树脂（OH-型）、大孔强酸性苯乙烯型阳离子交换树脂（Na-型）、1%丙三醇标准溶液、右旋葡萄糖和丙三醇溶液、1%麦芽糊精溶液。

1.2 供试品

自制复合纤维素颗粒（以抗性糊精、抗性淀粉为主要原料），粉碎后过50目筛，70 ℃真空干燥后置干燥器中冷却待用。

1.3 标准品

标准品有葡萄糖（纯度≥99%）、丙三醇（纯度≥99%）和抗性麦芽糊精（Resistant Malto Dextrin，RMD）。

2 结果与讨论

2.1 样品酶解

准确称取双份试样（M1和M2）各1 g，精确到0.1 mg，双份试样质量差不超过0.005 g，置于400 mL或600 mL高脚烧杯中，同时制备2个空白样用于校正试剂对测定的影响。加入0.05 mol/L MES-TRIS缓冲液40 mL，用磁力搅拌直至试样完全分散在缓冲液中。

2.1.1 热稳定α-淀粉酶酶解。加100 μL热稳定α-淀粉酶液缓慢搅拌，然后加盖铝箔，置于95～100 ℃的恒温振荡水浴箱中持续振摇。当温度升至95 ℃时开始计时，通常反应35 min。将烧杯取出，冷却至60 ℃，打开铝箔盖，用刮勺将烧杯内壁的环状物和烧杯底部的胶状物刮下，用10 mL蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。

2.1.2 蛋白酶酶解。向每个烧杯加入100 μL蛋白酶溶液，盖上铝箔，置于60 ℃±1 ℃水浴中持续振摇。当水温达到60 ℃时开始计时，反应30 min。打开铝箔盖，边搅拌边加入5 mL 3 mol/L乙酸溶液，控制试样温度保持在60 ℃，用1 mol/L氢氧化钠溶液或1 mol/L盐酸溶液调pH值至4.5±0.2（用pH计或以0.4 g/L溴甲酚绿为外指示剂）。

2.1.3 淀粉葡糖苷酶酶解。在上述溶液中边搅拌边加入300 μL淀粉葡萄糖苷酶液，盖上铝箔，继续于60 ℃±1 ℃水浴中持续振摇，当水温达到60 ℃时计时反应30 min。

2.2 样品测定

2.2.1 酶重量法。用酶重量法测定不溶性膳食纤维（Insoluble Dietary Fiber，IDF）和高分子质量可溶性膳食纤维（Soluble Dietary Fiber，SDF）。

①沉淀。在每份试样酶解液中，按乙醇与样液体积比4∶1加入预热至60 ℃±1 ℃的95%乙醇（预热后体积约为225 mL），取出烧杯，盖上铝箔，室温下沉淀1 h。

②过滤。取已加入硅藻土并干燥称重的坩埚，用15 mL 78%乙醇润湿硅藻土并展平，接上真空过滤装置，抽去乙醇使坩埚中硅藻土平铺于滤板上。将经乙醇沉淀的试样酶解液转移到坩埚中过滤，用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。

③洗涤。用20 mL 78%乙醇洗涤高型烧杯3次，在抽真空条件下洗坩埚中残渣，依次用洗烧杯后的20 mL 78%乙醇洗3次，10 mL 95%乙醇洗2次，10 mL丙酮冲洗2次。向滤液中加入10 mL内标溶液，然后用78%乙醇溶液定容至500 mL，混匀。

④浓缩。取200 mL滤液在50 ℃旋转蒸发至近干，用蒸馏水定容至50 mL。

⑤称量。将坩埚在70 ℃真空中干燥过夜。称量坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土的质量，精确到0.1 mg。减去坩埚和硅藻土的质量，计算不溶性膳食纤维（IDF）和高分子质量可溶性膳食纤维（SDF）在乙醇中沉淀的殘渣质量。

⑥灰分的测定。取双份试样中的一份残渣，按《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》（GB 5009.4—2016）测定试样中的灰分。

⑦蛋白质的测定。取双份试样中的另一份残渣，按《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）测定试样中的蛋白质。

2.2.2 液相色谱法。测定试样中的低分子质量抗性麦芽糊精（RMD）的含量。

①脱盐。在玻璃柱中加入溶胀好并充分混合的10 g OH-型多氨基弱碱性离子交换树脂和10 g转化为H-型的Na-型大孔强酸性苯乙烯型阳离子交换树脂。先用100 mL的水清洗，然后把50 mL溶液加入柱子中，再用100 mL的水洗脱，流速为0.8 mL/min。收集150 mL洗脱液，在50 ℃条件下旋转蒸发至近干，加少量水转移出来，定容至25 mL。溶液经0.45 μm水相滤膜过滤，待液相色谱分析用。

②色谱参考条件。色谱柱采用凝胶保护住（6.0 mm×40 mm，6 μm）和2个串联的凝胶色谱柱（7.8 mm×300 mm，6 μm）。流动相为超纯水，超声脱气30 min，流速为0.5 mL/min，柱温为80 ℃±1 ℃。进样量为50 μL和100 μL。检测器内部温度设定为50 ℃±1 ℃。

③样品中抗性麦芽糊精的测定。取100 μL右旋葡萄糖和丙三醇的溶液注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定3个不同浓度的右旋葡萄糖和丙三醇峰面积值。通过计算右旋葡萄糖峰面积与丙三醇峰面积的比值（y轴）和右旋葡萄糖质量与丙三醇质量的比值（x轴）所得曲线的斜率的倒数，得到右旋葡萄糖的响应因子（Response factor，RF）。

取50 μL的1%麦芽糊精溶液注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，确定色谱图中聚合度（Degree of Polymerization，DP）不小于3的葡萄糖聚合物的保留时间。取100 μL样液注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样中DP≥3的葡萄糖聚合物响应值（峰面积）。利用试样中DP≥3的葡萄糖聚合物峰面积与丙三醇峰面积的比值和试样中加入的丙三醇的量，得到抗性麦芽糊精的含量。

④检出限。空白基质添加抗性麦芽糊精（0.5 g/100 g）溶液，在相同条件下进样6次，测得仪器基线噪声为50 nRIU。

按检出限定义，抗性麦芽糊精（RMD）在此分析条件下的检出限数据如表1所示。抗性麦芽糊精的检出限色谱图如图1所示。

⑤标准工作曲线的绘制。根据《食品中膳食纤维的测定 酶重量法和酶重量法-液相色谱法》（GB/T 22224—2008）的规定，标准工作曲线只需要配制3个浓度点的葡萄糖标准物质溶液，即10.0 mg/25 mL、20.0 mg/25 mL、50.0 mg/25 mL，内标溶液丙三醇的浓度为40.0 mg/25 mL，将其依次注入高效液相色谱仪。通过计算右旋葡萄糖峰面积与丙三醇峰面积的比值（y轴）和右旋葡萄糖质量与丙三醇质量的比值（x轴）所得曲线的斜率的倒数，得到右旋葡萄糖的响应因子（RF），如表2所示。标准工作曲线如图2所示，葡萄糖和丙三醇标准色谱图如图3所示。所得线性方程为y=1.207x+0.030，线性相关系数R2为0.999，响应因子为0.828。

⑥精密度。在同一实验室内，由同一操作者使用新建的色谱定量分析方法，在较短时间间隔内使用同一仪器对相同样品进行分析测定。样品复合纤维素颗粒中水溶性膳食纤维含量、相对标准偏差數据如表3所示。经计算，水溶性膳食纤维检测结果的平均值为65.78 g/100 g，标准偏差S为0.34 g/100 g，相对标准偏差为0.52%。空白色谱图如图4所示，样品色谱图如图5所示。

⑦回收率试验（准确度）。由于复合纤维素颗粒样品中水溶性膳食纤维含量较高（大于65 g/100 g），无法直接在此样品中进行添加回收试验，因此选择在空白基质样品中加入一定已知浓度的抗性麦芽糊精标准样品，按照相同的检验方法进行测定。测得的样品回收率如表4所示。添加水平0.5 g/100 g下，回收率平均值为96.6%，RSD为1.53%;添加水平5.0 g/100 g下，回收率平均值为99.3%，RSD为1.57%;添加水平50.0 g/100 g下，回收率平均值为99.7%，RSD为1.69%。不同添加水平下的加标试验色谱图如图6至图8所示。

2.2.3 酶重量法-液相色谱法样品测定。采用酶重量法-液相色谱法测定了6份样品复合纤维素颗粒的水溶性膳食纤维含量，平均含量为65.78%，RSD为0.52%。

3 结语

采用酶重量法测定试样中不溶性膳食纤维（IDF）和高分子质量可溶性膳食纤维（SDF）的含量，运用液相色谱法测定试样中低分子质量抗性麦芽糊精（RMD）的含量。两者结合测定了多份含低分子质量抗性麦芽糊精食品的总膳食纤维含量，RSD为0.52%，结果令人满意。该复合方法灵敏度、准确率高，可以用于含低分子质量抗性麦芽糊精水溶性膳食纤维食品中总膳食纤维的测定。

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