蚕蛾公补合剂对少弱精子症患者精液Wnt/β-catenin信号通路的影响

赵 珂，赵 玉，陈少峰，李 重，孙 远，王 福，耿 强*

1.天津市中医药研究院附属医院 妇科，天津 300091

2.天津中医药大学第一附属医院 男科，天津 300193

3.中国中医科学院西苑医院 男科，北京 100091

男性不育症是影响社会稳定及家庭和谐的全球性问题[1]，世界范围内有7000 万对夫妻存在生育力低下或不育的状况[2]，其中接近40%由男方因素引起[3]。少弱精子症是引起男性不育症的重要因素之一，目前现代医学针对少弱精子症的治疗无特效药物[4]，亦或选择辅助生殖技术孕育子代，但仍存在高成本、患者接受度低以及后续子代健康风险等诸多问题。中医药治疗男性不育症历史悠久，积累了大量的临床经验并取得了较好的疗效，如以补肾益精为主要功效的中成药五子衍宗丸可改善精子质量，治疗少弱精子症[5]。蚕蛾公补合剂是一种以名贵药材雄蚕蛾提取物为君药配伍制成的现代中药制剂，具有补肾助阳、养血填精之功效，同时现代研究发现 Wnt（一类分泌性糖蛋白）/β-链蛋白（β-catenin）信号通路参与睾丸的生精过程[6]。本研究拟通过运用蚕蛾公补合剂治疗少弱精子症患者，评价其临床疗效并探讨其作用机制，为中医药治疗少弱精子症提供临床参考和试验依据。

1 研究对象

1.1 病例选择

选取2018年1月—2019年12月就诊于天津市中医药研究院附属医院、天津中医药大学第一附属医院和中国中医科学院西苑医院门诊患者60 例，入组前均签署知情同意书，将纳入患者按照随机数字表法随机分为治疗组及对照组，每组30 例，平均年龄（29.50±3.26）岁，平均病史（16.10±3.34）月。两组基线资料间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验通过中国中医科学院西苑医院实验伦理审查委员会审批（批准号2018XLA084-2）。

1.2 纳入标准

（1）符合西医诊断标准，包括男性不育症和少弱精子症的诊断。诊断标准参考《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5 版。男性不育症：在未采取避孕措施情况下，同居1年或1年以上，配偶未怀孕，并排除女方因素。少精症：精子浓度低于下限值即1.5×107/mL；弱精子症：表现为精子活力降低，前向运动精子活动率＞10%，且＜32%。（2）符合中医肾阳虚的诊断标准。参照《中药新药临床研究指导原则》[7]，主症：腰膝酸软，性欲减退，畏寒肢冷；次症：精神萎靡，夜尿频多，下肢浮肿，动则气促，发槁齿摇，舌质淡苔白，脉沉迟，尺无力。具备以上主症2 项，次症2项，即可诊断肾阳虚证。（3）20 岁＜年龄＜40 岁。（4）患者存在2 次及以上精液异常。（5）所有患者均在本研究治疗前2 周内未服用任何避孕药。

1.3 排除标准

（1）近期服用过肿瘤化疗药、柳氨磺胺吡啶、呋喃妥英等对精子生成、活力具有影响的药物；（2）存在严重肝、心等系统性疾病；（3）存在药物过敏史；（4）存在中、重度附属性腺或生殖道感染。

2 方法

2.1 给药方案

治疗组给予蚕蛾公补合剂（批号2017011，太极集团四川南充制药有限公司），口服3 次/d，每次10 mL。对照组给予口服五子衍宗丸（60 g/瓶，水丸制剂，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号Z11020241），每次6 g，2 次/d，两组均以12周为1 个疗程，治疗1 个疗程。

2.2 疗效标准

显效：精子数量及精子活力增加2/3；有效：精子数量及精子活力增加1/3；无效：精子数量及精子活力增加不明显或降低；总有效率＝(显效例数＋有效例数)/总例数。

2.3 精液常规指标检测

嘱受试者禁欲2～7 d，采用手淫取精液，液化后做精液常规分析，采用精液全自动分析系统（北京伟力科技有限公司生产）进行精子密度和精子活力的分析。剩余标本在低速水平离心机（北京白洋医疗器械有限公司）中以3000×g离心15 min，用一次性吸管进行精浆及精液沉淀物分离，分别放置在洁净EP 管内，冰箱−4 ℃冷冻层内保存待用。

2.4 RT-PCR 检测Wnt/β-catenin mRNA 表达

液氮保存组织解冻，移入研钵中，加入1 mL TRIzol，反复研磨，将匀浆样品在室温放置5 min；于2～8 ℃、10 000 r/min 离心10 min，取上清；每使用1 mL TRIzol 加入0.2 mL 氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min；2～8 ℃ 10 000 r/min 离心15 min。样品分为黄色有机相、无色水相和中间层。将水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA。移去上清，用75%乙醇洗涤RNA 沉淀。2～8 ℃不超过7500 r/min 离心5 min，弃上清；室温放置干燥或真空抽干RNA 沉淀，晾5～10 min。加入25～200 µL无RNase 的水或0.5% SDS，用枪头吸打几次，55～60 ℃放置10 min 防止RNA 溶解，−70 ℃保存。以U6 作为内参对照，使用SYBR 荧光染料试剂盒进行荧光定量 PCR 检测，采用 2−∆∆Ct方法对Wnt/β-catenin mRNA 的相对表达量进行分析。

2.5 Western blotting检测Wnt/β-catenin蛋白表达

取液氮保存的组织解冻，与裂解液一起加入研磨器中，冰上研磨裂解10 min，移入离心管中，在超速冷冻离心机中4 ℃、14 000 r/min 离心15 min，收集上清于Eppendorf 管中，BCA 法测定总蛋白浓度，将蛋白样品与蛋白电泳上样缓冲液混合，沸水煮10 min，备用。采用Western blotting 法检测：10%SDS-PAGE 凝胶电泳，使用多功能电泳仪将蛋白转移至PVDF 膜，将该膜在室温下封闭2 h，PBST 液漂洗3 次，每次10 min，与一抗（1∶500）4 ℃孵育过夜，PBST 漂洗3 次，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶1000）孵育2 h，PBST 液洗膜3 次，每次10 min，ECL 化学发光显影。用Jmage 分析软件扫描杂交条带灰度值。结果用目的蛋白条带与肌动蛋白（Actin）条带灰度值的比值表示，并且使用Actin 进行校正。

2.6 统计学方法

采用SPSS19.0 统计软件进行分析，计量资料采用±s表示，数据符合正态分布，t检验两组间差异。

3 结果

3.1 病例脱落情况

本研究纳入60 例患者，试验完成时，两组均没有病例脱落，患者依从性好。

3.2 两组疗效比较

治疗组总有效率高于对照组，但无统计学差异，即蚕蛾公补合剂与五子衍宗丸治疗总有效率无明显差异。结果见表1。

3.3 精子质量情况变化

对照组和治疗组较服药前，精子密度和精子活力均显著增加（P＜0.01）；治疗后，与对照组比较，治疗组精子密度和精子活力显著增加（P＜0.01）。见表2。

表1 两组患者疗效比较Table 1 Comparison of efficacy between two groups

表2 精子质量变化Table 2 Change of sperm quality

3.4 精液中Wnt/β-catenin mRNA 和蛋白表达情况

与对照组相比，治疗组精液中Wnt/β-catenin mRNA 和蛋白表达增加，差异显著（P＜0.01）。见图1、2。

3.5 不良反应

治疗组患者中出现1 例恶心、胃脘不适症状，经抑酸护胃等对症治疗后消失。对照组未出现严重不良反应，两组均无因不良反应退出本次临床观察的情况。

4 讨论

图1 精液中Wnt/β-catenin mRNA 表达情况Fig.1 Expression of Wnt/β-catenin mRNA in sperm

图2 精液中Wnt/β-catenin 蛋白表达情况Fig.2 Expression of Wnt/β-catenin protein in sperm

中医学对男性不育症的认识已有数千年历史，属“精冷”“无子”范畴。《黄帝内经》中就记载了以天癸为媒介，以肾为中心的经典生殖学说，并沿用至今。肾为先天之本，主生殖，肾中阳气不足，命门火衰以致无力生发肾中阳气以生精，可引起男子精冷、精少而不嗣，故在治疗时以补肾作为治疗少弱精子症的基本法则[8]。另有报道显示，现代男性不育症的主要证型以肾阳虚证为主[9]。蚕蛾公补合剂由雄蚕蛾、人参、熟地黄、当归、补骨脂、枸杞子、菟丝子、仙茅、肉苁蓉、淫羊藿、蛇床子组成，具有补肾壮阳、养血填精之功效。蚕蛾由蚕蛹蜕皮羽化而成，成虫期的雄性蚕蛾生殖器官十分发达[10]，同时亦可药用，《本草述钩元》中记载：“雄蛾，味咸，气温热，主益精气，止泄精尿血，治遗精赤白浊”，故本方以雄蚕蛾固精壮阳为君药，人参、熟地黄、补骨脂益气补肾助阳，共为臣药；佐以当归活血补血，枸杞子滋阴填精，仙茅、菟丝子、肉苁蓉、淫羊藿、蛇床子益肾助阳。

Wnt/β-catenin 信号通路作为最为经典的Wnt 信号通路，参与众多体细胞的生命活动及进程[11-12]。有研究发现，Wnt/β-catenin 信号通路能够在肾阳虚的患者体内表达[13]；另有研究发现，成年男性睾丸支持细胞中存在Wnt/β-catenin 信号通路的表达，并且激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进睾丸支持细胞的增殖，从而改善生精功能[6]。本研究表明，具有补肾助阳填精功效的蚕蛾公补合剂能够显著改善少弱精子症患者的精子质量和活力（P＜0.01）；激活少弱精子症患者睾丸中Wnt/β-catenin 信号通路，通过调控此通路进而改善睾丸生精功能，提升精子质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突