基于方证对应探讨中药复方分期治疗新型冠状病毒肺炎的网络药理学机制

郭 琴，王 颖，王欢欢，柏 冬*

1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 1007001

2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）爆发以来，引起了全球各界的关注。2020年2月11日国际病毒分类委员会（ICTV）宣布，将新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。在治疗COVID-19 的过程中，中医药的参与度极高，且获得了确切的疗效，COVID-19 在中医上属于“疫”的范畴，病位在肺，中医认为 COVID-19 患者主要由外邪入侵（SARS-CoV-2 感染）和正气不足（人体免疫力下降）引发，后期由于机体和脏腑功能失调使得疾病进一步加重[1]。中医强调“扶正”和“祛邪”，注重整体观和三因制宜，在疫情的防控中发挥着积极的作用。COVID-19 的病情变化具有明显的阶段性，且病情轻重在临床诊疗中易于识别，因此分期论治具有合理性和必要性[2]。在国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第7 版[3]中，中医采取了分期治疗的方式，将疾病的临床治疗期分为轻型、普通型、重型、危重型和恢复期5 个阶段。

中医以整体观念和辨证论治为治疗原则，其中“证”是中医特有的概念和核心内容，能够反映疾病发生过程中某一阶段病理变化的本质，患者感染SARS-CoV-2 后会因为自身体质、地区和疾病阶段而表现为不同的证型，因此利用现代医学和生命科学等技术和方法，从新的视角深入阐释中医证候的形成原因对中医药现代化具有重要意义[4]。张伯礼院士团队[5]结合全国各地病例和治疗方案，发现COVID-19的病因多归为“湿或湿热之邪”，认为此病当为“湿毒疫”，并将核心病机归纳为“寒、湿、热、毒、瘀、闭、虚”。基于此，本研究选择了《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第7 版[3]中的湿热蕴肺证（轻型）、湿毒郁肺证（普通型）、气营两燔证（重型）、内闭外脱证（危重型）和气阴两虚证（恢复期）5 个证型及其对应复方为研究对象，使用网络药理学的方法，对5 个证型的证候表现及其所用复方的靶点和通路进行预测和挖掘，以期阐明各证型的分子作用机制。

1 方法

1.1 5 个证型所用复方的活性成分及其靶点的收集

以湿热蕴肺证（轻型）、湿毒郁肺证（普通型）、气营两燔证（重型）、内闭外脱证（危重型）和气阴两虚证（恢复期）5 个证型所用复方的中药为研究对象，使用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中药综合数据库（TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）和检索文献获得各中药的主要活性成分，其中TCMSP 数据库的筛选参数为口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug like index，DL）≥0.18。利用TCMSP 数据库、Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）和Pharmmapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）获得各中药主要活性成分的作用靶点。

1.2 5 个证型临床表现的靶点收集

对湿热蕴肺证（轻型）、湿毒郁肺证（普通型）、气营两燔证（重型）、内闭外脱证（危重型）和气阴两虚证（恢复期）的临床表现进行整理，使用Geen Card 数据库（https://www.genecards.org/）、TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）和 OMIM 数据库（https://www.omim.org/）检索各证型临床表现的靶点。

1.3 蛋白互作（protein-protein interactions，PPI）网络的构建

对各复方活性成分的靶点和各证型临床表现的靶点取交集，将各证型的交集靶点上传至STRING 数据库（https://string-db.org/），设置生物物种为人，置信度≥0.400，将构建的PPI 网络信息导入Cytoscape3.8.0 软件，计算度（degree）值，基于cytoHubba 插件的拓扑算法预测网络中重要的蛋白节点和子网，并进行可视化处理。

血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是SARS-CoV-2 S 蛋白的受体，介导病毒进入靶细胞。在小鼠急性肺损伤模型中，与野生型小鼠相比，ACE2 基因敲除小鼠的肺功能显著恶化，而注射外源性重组人ACE2 可减轻肺损伤程度[6]，说明在SARS-CoV-2的致病过程中，ACE2不仅是病毒进入细胞的受体，也是病毒引发肺损伤的靶分子[7]。因此，将ACE2 蛋白与各复方筛选得到的关键蛋白共同导入STRING 数据库构建PPI 网络，查看复方的关键蛋白与ACE2 蛋白的相互作用。

1.4 京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

将交集靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），选择生物物种为人，设定阈值为P≤0.05，将富集结果的前20 条通路进行可视化处理。

2 结果

2.1 5 个证型所用复方的活性成分和靶点分析

以OB≥30%、DL≥0.18 为筛选参数，检索TCMSP 数据库中COVID-19 的5 个证型复方的主要活性成分和靶点。对于TCMSP 数据库中不包含的中药生石膏、水牛角、安宫牛黄丸、麦冬和生地通过TCMID 数据库检索其主要活性成分，竹叶（淡竹叶）[8-10]、化橘红[11-12]、地龙[13]和焦三仙（焦山楂[14-15]、焦神曲[16-19]）通过检索文献获得主要活性成分，并使用Swiss Target Prediction 数据库获得其靶点蛋白。生石膏所含成分使用Pharmmapper 数据库获得其作用靶点。

忽略炮制方式，5 个证型复方所含中药的主要活性成分及其作用靶点见表1。其中，湿热蕴肺证（轻型）复方包含12 种中药，检索到188 个活性成分及260 个靶点；湿毒郁肺证（普通型）复方包含13 种中药，检索到162 个活性成分及340 个靶点；气营两燔证（重型）复方包含12 种中药，检索到194 个活性成分及437 个靶点；内闭外脱证（危重型）复方包含4 种中药，检索到46 个活性成分及163 个靶点；气阴两虚证（恢复期）复方包含10 种中药，检索到253 个活性成分及431 个靶点。

表1 COVID-19 的5 个中医证型复方所含中药的活性成分和靶点数Table 1 Number of active ingredients and targets of TCM contained in five syndromes related compounds of COVID-19

2.2 5 个证型临床表现的靶点

将COVID-19 的5 个证型的临床表现及其对应检索词进行整合，利用Geen Card、TTD 和OMIM数据库检索各证型临床表现的靶点，见表2。

2.3 5 个证型及其对应复方的交集靶点

对COVID-19 的5 个证型的临床表现及其复方的靶点取交集，如图1所示，5 个证型及其对应复方的交集靶点数目分别是252、322、402、140、399，结果表明5 个证型复方对COVID-19 相关证型具有调控作用。

2.4 PPI 蛋白互作网络和KEGG 通路分析

将交集靶点上传至SRTRING 数据库得到的PPI 网络导入Cytoscape 3.8.0 软件，通过CytoHubba插件以度为条件进行拓扑分析，分别筛选出排名前10 的关键蛋白，获得的关键蛋白如图2所示，颜色由红至黄代表度值从大到小。其中，5 个证型复方的关键蛋白都包括血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、胱天蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、蛋白激酶B1（proteinkinase B1，PKB1 或AKT1），说明这4 个靶点在治疗COVID-19 的过程中具有重要作用。将5个证型复方的关键蛋白与ACE2 蛋白共同导入STRING 数据库后得到的PPI 网络如图3所示，表明5个证型复方的关键蛋白与ACE2蛋白关系密切，其中丝裂原激活蛋白激酶 8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、白细胞介素-6（IL-6）和血清白蛋白（albumin，ALB）对ACE2 蛋白有直接作用。

表2 COVID-19 的5 个中医证型的临床表现及其靶点数Table 2 Clinical manifestations of five syndromes of COVID-19 and their target number

图1 COVID-19 的5 个证型及其对应复方的靶点Wenn 图Fig.1 Target Wenn diagram of five syndromes of COVID-19 and their corresponding compounds

图2 COVID-19 的5 个证型相关复方的PPI 网络-通路图和关键蛋白Fig.2 PPI network-pathway diagrams and key proteins of five syndromes related compounds of COVID-19

基于DAVID 数据库分别对5个证型复方的交集靶点进行KEGG 富集分析，通过Cytoscape 3.8.0 软件将P（≤0.05）值排名前20的通路与复方的PPI网络整合，得到5 个复方的PPI 网络-通路图，如图2所示，其中紫色矩形代表交集靶点，红色矩形代表通路。

图3 COVID-19 的5 个证型复方的关键蛋白与ACE2 蛋白的PPI 网络Fig.3 PPI network of key proteins of five syndromes related compounds of COVID-19 and ACE2 protein

图4 COVID-19 的5 个证型复方的通路热图Fig.4 Pathways heat map of five syndromes related compounds of COVID-19

分别将COVID-19 的5 个证型复方排名靠前的通路及其P值以热图的形式进行整合，见图4。其中P值由小到大对应颜色由红色过渡至绿色，可以看出5 个证型复方干预的通路类型大体相似，但各复方干预通路的侧重点不同，除内闭外脱证型复方外，其他4 个证型复方都对乙型肝炎（hepatitis B）、肿瘤坏死因子信号通路（tumor necrosis factor signaling pathway）、缺氧诱导因子-1 信号通路（hypoxia inducible factor-l signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease，American trypanosomiasis）、非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer）和NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）等通路干预性较强。

3 讨论

中医药从证候到复方都是在“辨证论治”和“整体观念”的指导下对疾病进行干预，中药及其复方具有多成分、多靶点和多途径的特点，这些特点为中医药研究者带来了挑战，而网络药理学的出现为中医药研究提供了新的思路。网络药理学基于药物和疾病间的相互作用，在体外通过计算机虚拟技术构建了“药物-成分-靶点-通路-疾病”的多层次网络，具有整体性和系统性的特点[20]，与中医药的指导思想趋于一致，众多研究者将网络药理学应用于中医药，以解释中医药复杂的作用机制。在治疗COVID-19 方面，中医药工作者从证型出发，根据患者的不同症候给予不同的治疗方案，而应用网络药理学可实现对疾病、证候、中药及其复方作用机制的挖掘，为COVID-19 的治疗提供借鉴和参考。许海玉课题组[21]以“症状”为切入点，通过中药整合药理学网络计算平台2.0，对COVID-19 中4 个时期的代表证候方剂构建了分子网络，探讨了4 个时期COVID-19 的生物学基础及推荐方剂对证治疗的分子机制，对于揭示推荐方剂的作用原理和科学内涵具有重要意义。本研究基于中医“方证对应”的特点，运用网络药理学对COVID-19 发展过程中5 个证型的证候表现及其所用复方的靶点和通路进行预测和挖掘，以期阐述中医“对证”和“对症”治疗的优势和特色，解释中医分期治疗的合理性。

本研究基于网络药理学对《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第7 版的5 个证型及其对应复方进行分析探讨，使用数据库分别筛选出5 个证型临床表现的靶点及其所用复方主要活性成分的靶点，通过5 个证型的交集靶点构建PPI 互作网络并获得关键蛋白，其中5 个证型相关复方的关键蛋白都包括VEGFA、EGFR、CASP3、AKT1。其中VEGFA是刺激血管生长的主要因子之一，在激活信号通路和诱导内皮细胞增殖和迁移等方面具有重要作用[22]，药效学实验表明VEGFA 水平的升高很有可能与肺部炎症消退有关[23]。EGFR 是非小细胞肺癌中最常见的驱动因子之一，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂是非小细胞肺癌的重要治疗手段之一[24]，并且非小细胞肺癌通路也出现在通路富集结果中，说明EGFR 靶点和非小细胞肺癌通路与COVID-19 具有相关性。CASP3 是一种蛋白酶，与细胞凋亡等生理过程中具有重要意义，杨波等[25]研究发现在小鼠感染SARSCoV 导致的心脏损伤和肝脏损伤过程中，CASP3具有显著调节相关信号通路的作用。AKT1 可通过通路传导调节细胞代谢、促进细胞生长和增殖等，同时还具有抑制细胞凋亡作用[26]，梁木林等[27]发现p-AKT1 参与了高氧肺损伤的发生发展，其调控机制可能与抑制mTOR 信号通路的活化有关。目前大部分研究表明，ACE2 蛋白是SARS-CoV-2 作用于人体的关键蛋白，也是治疗COVID-19 的核心靶点[7,28]，本研究将5 个证型相关复方的关键蛋白与ACE2 蛋白作PPI 网络发现，MAPK3、IL6 和ALB 对ACE2蛋白有直接的相互作用，其余关键蛋白也可间接作用于ACE2 蛋白，说明5 个证型相关复方可作用于SARS-CoV-2 S 的关键蛋白受体（ACE2），从而发挥抗病毒作用。

取交集靶点进行KEGG 通路富集分析，得到每个证型所用复方的基因信号通路，并将排名靠前的通路及其P值以热图的形式进行整合，发现除内闭外脱方外，其余4 个复方主要通过干预乙型肝炎、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路、恰加斯病、非小细胞肺癌和小细胞肺癌通路等来治疗COVID-19，说明4 个证型相关复方在治疗其对应证型时具有相同的生理病理基础，分别是①抗病毒作用：4 个复方主要干预卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎和恰加斯病等与病毒相关的通路。②抑制炎症反应，增强免疫应答：TNF 可促进T 细胞产生各种炎症因子，诱导多种细胞内信号通路，包括细胞凋亡和细胞存活以及炎症和免疫力[29]；HIF-1 是由α 亚基和β 亚基构成的异源二聚体，为细胞适应缺氧的主要转录因子和核心调控器，是缺氧应急的关键因子，调控细胞的多种缺氧反应，参与多种疾病的生理病理反应，包括癌症、炎症和免疫等[30]；③4 个证型相关复方还主要干预非小细胞肺癌和小细胞肺癌2 个与肺部有关的通路，说明其对靶器官（肺）的保护作用。

湿热蕴肺证（轻型）和湿毒郁肺证（普通型）为COVID-19 的初期，在这个过程中，病毒开始侵入机体，并伴随发热、咳嗽、胸闷等症状，张鹏葛等[31]总结中医治疗COVID-19 的处方用药规律发现，初期以化痰止咳平喘、清热泻火、发汗解表为主，中药在这一阶段发挥了较大作用，热图结果也显示，这2 个证型相关复方显著干预的通路较多，广泛作用于甲型流感和小细胞肺癌等与病毒、流感相关的信号通路，且二者还显著作用于磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路和叉头转录因子（forkheadboxclass O，FoxO）信号通路等，PI3K-Akt-FoxO 信号通路是调节细胞凋亡的重要途径。PI3K 催化第2 信使磷脂酰肌醇(3,4,5) 三磷酸等的生成，从而激活磷脂酰肌醇依赖性激酶，后者可使Akt 磷酸化而激活。而FoxO 转录因子是PI3K-Akt 信号转导通路的下游因子之一，当PI3K-Akt 途径被激活，活化的Akt 会催化FoxO多个位点的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化修饰，从而抑制FoxO 活性，引发PI3K-Akt-FoxO 信号通路的生物学效应[32]，调控机体内的细胞增殖和凋亡过程。

气营两燔证和内闭外脱证为COVID-19 的重症期，此时患者表现为高热、烦渴、呼吸困难，甚者出现呼吸衰竭、休克、神昏谵语等症状，严重者器官衰竭，此时中药复方需和中药注射剂如血必净注射液、生脉注射液联合使用，重症期患者胸部CT主要表现为双肺弥漫性实变，其内可见支气管扩张或空气支气管征，双肺大部分受累时呈“白肺”表现[33]，因此这一阶段必要时还需进行呼吸支持和挽救治疗，王利等[34]认为COVID-19 患者后期病情加重与细胞因子风暴有关，西医学对重症患者的治疗虽靶点明确，但作用单一，而中医药多靶点、多途径、多层次，作用广泛，整体治疗优势突出，在面对细胞因子风暴等复杂疾病的防治中体现出了较高的价值[35]。KEGG 富集结果显示气营两燔证和内闭外脱证相关复方显著干预的通路虽不及其他3 个证型的复方范围广，但二者对神经活性配体-受体相互作用通路的干预较为显著，说明二者着重缓解神经系统的异常，以恢复机体神志。

气阴两虚证是COVID-19 的恢复期，此时患者余邪未尽，但高热已退，神志恢复，气阴两虚证相关复方显著干预PI3K-Akt 信号通路，该通路有多种下游信号蛋白，可凭借繁多的下游信号蛋白来调节基本的细胞功能，如转录、翻译、增殖、生长、存活和凋亡[36]；该复方还显著干预类固醇激素的合成、鞘脂信号通路和氮代谢等信号通路。An 等[37]发现与非治疗组相比，恢复期服用中药复方的COVID-19 患者免疫反应（白细胞、淋巴细胞和单核细胞数目显著减少）、肝功能（γ-谷氨酰转肽酶明显降低、前白蛋白明显改善）和造血凝血功能（血小板、红细胞和血红蛋白明显增加）均有所改善。这说明恢复期中药复方主要参与细胞生长过程，调控机体的能量代谢和营养物质吸收过程，以增强机体免疫和扶助机体正气。

综上所述，5 个COVID-19 的中医证型相关复方的作用通路具有一定相似性，主要通过抗病毒、抑制炎症反应、增强免疫应答和保护主要靶器官来治疗COVID-19，但各有特点，湿热蕴肺证和湿毒郁肺证相关复方侧重于干扰病毒并增强机体的免疫应答；气营两燔证和内闭外脱证相关复方着重缓解神经系统的异常，以恢复机体神志；气阴两虚证相关复方进一步参与细胞生长过程和调节机体的能量代谢和吸收过程，以增强机体免疫和扶助正气，说明了中医辨证论治和方证对应的治疗特点，解释了中医分期治疗COVID-19 的合理性和科学性。

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