左心室心肌致密化不全患者致密层心肌Native T1 值与基质金属蛋白酶-9 的相关性研究

周红梅，丁海艳，方全，方理刚，林雪

左心室心肌致密化不全（left ventricular noncompaction，LVNC）为胚胎期心外膜向心内膜致密化过程的失败，导致的心肌组织形成无功能的肌小梁和致密层心肌变薄的疾病。LVNC 的临床表现从无症状到难治性心力衰竭、猝死和血栓事件[1-3]。我们认为LVNC 患者心肌致密化层的组织学改变，尤其是纤维化程度，在此基础上导致或者合并心肌重构，可能是LVNC 患者临床表现不同的原因。在临床中寻找与心肌重构相关的方便可靠的、可反映致密层心肌组织改变的指标，有助于在具有LVNC 表型患者中筛查出预后不良患者。

近年来研究显示，心脏核磁共振（CMR）Native T1 mapping 可以有效早期检测并定量心肌纤维化[4-5]。但对于LVNC 患者致密层心肌Native T1 mapping 定量检测是否存在异常鲜有研究。我们前期研究显示，致密层Native T1 值与QTc 间期有显著的相关性；QTc 间期越长，Native T1 值越高，且预后较差[6]。

此外，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是临床研究中常用的与组织重构相关的指标，在心肌纤维化的进程发挥了至关重要的作用，尤其在终末期心力衰竭中MMP-9 显著增加，与病理性心肌重构密切相关[7-8]。在本探索性研究中，我们探讨了LVNC 患者致密层心肌Native T1 mapping 定量数值与心肌重构指标MMP-9 之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

研究纳入2008 年12 月至2014 年6 月期间在北京协和医院就诊，经两名资深的心内科医师通过超声心动图学检查确诊的32 例LVNC 患者，排除禁忌证后进行CMR 扫描。1 例患者因核磁图像质量不佳被剔除，最终31 例LVNC 患者纳入LVNC 组，其中男性17 例，女性14 例，年龄16～65 岁，平均年龄（42.1±15.2）岁。纳入标准：经临床确诊为LVNC、NYHA 心功能Ⅰ～Ⅲ级。排除标准：LVNC患者NYHA 心功能Ⅳ级、植入心脏起搏器或金属置入体内者、幽闭恐惧症者及妊娠女性。另招募性别和年龄相匹配的健康志愿者（均为LVNC 患者家属）10 名为健康对照组。健康对照组入组标准：无心血管疾病危险因素，包括无吸烟史、高血压、高血脂、糖尿病等疾病病史；无长期服药史，无幽闭恐惧症，无钆对比剂过敏，无金属置入体内者，常规十二导联心电图、超声心动图、血常规、肝功能、肾功能及血脂检查均正常。本研究经北京协和医院伦理委员会批准，所有受试对象均签署知情同意书。

1.2 心脏核磁共振扫描方法

采用荷兰Achieva TX,Philips 3.0 T 超导型磁共振仪，梯度场强45 mT/m，切换率每秒200 T/m。采用胸前置32 通道心脏线圈（InVivo,Gainesville,Florida,美国），心电门控R 波触发成像。所有受试者均行心脏电影成像（CINE）序列：门控导航的稳态自由进动梯度回波电影序列（bSSFP）扫描参数：TR 270 ms、TE 1.3 ms、体系（voxel）大小1.8 mm3×1.5 mm3×8.0 mm3，反转角35°、层厚8 mm、层间空隙2 mm。MOLLI序列：在图像采集过程中要求患者屏气，通过两个反转脉冲，在11 个心脏周期中共采集8 幅具有不同翻转时间的T1 权重的图像。图像来自左心室中部的短轴位，共采集三层，层间隔为20 mm，全部图像可以覆盖心脏中部的50 mm 以内范围。详细的成像参数为:bSSFP 单次激发数据采集方式，TR/TE=2.5/1.1 ms，FOV:300 mm× 150 mm，voxel 大小：1.5 mm3× 1.5 mm3× 10.0 mm3，35°翻转角。

1.3 CINE 图像分析

由两名有经验的心内科及磁共振诊断医师阅片。依据美国心脏协会（AHA）标准17 节段分段法[9]，在CINE 图像上统计每例LVNC 患者非致密层心肌（NC）的部位和数量。在左心室舒张末期长轴位测量致密层心肌（C）厚度、NC 厚度。统计NC 的最大厚度及相对应的C 值，并计算相应的NC/C值。在CINE 图像上定量分析左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室射血分数（LVEF）和左心室致密层心肌质量（LVCM），测量分析LVCM 时未包括乳头肌质量。另外，由于NC 网状结构与心腔内血液相通，在分析时很难区分血液信号和NC 信号，故未计算NC质量。以上分析有两名核磁图像分析超过2 年的研究者在MATLAB（MathWorks,Natick,Massachusetts，美国）平台上进行，手工测量每个心动周期从心尖到基底部的每个相位的图像。

1.4 外周血MMP-9 实时PCR 和蛋白表达检测

LVNC 组患者及健康对照组受试者均在空腹时静脉采血2 ml。血样放入1.5 mg/ml 的乙二胺四乙酸（EDTA）试管中，离心10 min（3 000 转/min）。提取信使RNA（mRNA）主要应用试剂有Trizol 裂解液（Sigma 公司，美国），紫外分光光度计上测定RNA 的吸光光度值。mRNA 逆转录为互补DNA（cDNA）主要应用试剂有Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）。实时PCR 引物MMP-9 Forward:TGTACCGCTATGGTTACACTCG，MMP-9，Reverse:GGCAGGGACAGTTGCTTCT，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GRAPH）引物Forward:5'-TCAACGGATTTGGTCGTATT-3',Reverse:5'-CTGTGGTCATGAGTCCTTCC-3'。RNeasy Mini Kit总RNA 提取试剂盒（QIAGEN 公司，德国）、cDNA Archive Kit（Applied Biosystems 公司，美国）；GRAPH 试剂盒（Thermo Scientific 公司，美国）。外周血MMP-9 含量采用ELISA 试剂盒（R&D 公司，美国）测定，具体操作步骤根据操作指南进行。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计分析软件进行统计学分析。所有连续变量值用均数±标准差表示。组间比较采用非参数Mann-Whitney 检验。采用Spearman 非参数检验分析外周血MMP-9 蛋白与Native T1 值之间的关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LVNC 组与健康对照组的临床基本资料比较（表1）

LVNC 组与健康对照组的性别、年龄、体表面积的差异均无统计学意义（P均＞0.05），除高血压外，两组的其他心血管危险因素的差异也均无统计学意义（P均＞0.05）。LVNC 组患者中有9 例（29.0%）有LVNC 家族史，24 例（77.4%）患者有胸痛/胸闷症状，10 例（32.3%）患者有心悸，2 例（6.5%）患者有系统性血栓，23 例（74.2%）存在心电图异常。

表1 LVNC 组与健康对照组的临床基本资料比较[例（%）]

2.2 LVNC 组与健康对照组的CMR 的CINE 结果比较（表2）

LVNC 患者CMR 显示网状样的非致密化心肌显著增多（图1）。在校正体表面积后，两组的左心室舒张末期容积指数（LVEDVI）、左心室收缩末期容积指数（LVESVI）及LVEF 差异均有统计学意义（P均＜0.001）。

2.3 LVNC 组与健康对照组的致密层心肌Native T1值比较

健康对照组1 例受试者和LVNC 组1 例患者的Native T1 maps 图像见图2。数据分析显示，LVNC 组患者Native T1 值高于健康对照组[（1 159.0±47.4）ms vs.（1 096.0±41.5）ms，P＜0.001]。

2.4 外周血MMP-9 mRNA 水平及MMP-9 蛋白水平（图3）

LVNC 组MMP-9 mRNA 水平显著高于健康对照组（19.59±17.76 vs.1.76±0.72，P=0.003）。LVNC组MMP-9 蛋白水平显著高于健康对照组[（92.44±62.26）ng/ml vs.（58.32± 28.19）ng/ml，P=0.025]。

2.5 外周血MMP-9 蛋白与Native T1 值的相关性分析（图4）

Spearman 非参数检验结果显示，LVNC 患者外周血MMP-9 蛋白水平与Native T 值呈显著正相关（r=0.40，P=0.044）。

表2 两组心脏核磁共振成像参数比较（±s）

表2 两组心脏核磁共振成像参数比较（±s）

注：LVNC：左心室心肌致密化不全

图1 一例LVNC 患者的心脏核磁共振成像检查结果

图2 健康对照组和LVNC 组患者的Native T1 maps 图像

图3 两组外周血MMP-9 mRNA 水平及MMP-9 蛋白水平比较

图4 Spearman 非参数检验结果

3 讨论

本组研究中发现，LVNC 患者致密层心肌的Native T1 值、MMP-9 mRNA 水平及蛋白水平的表达均显著高于健康对照组，且外周血MMP-9 的浓度与Native T1 值呈正相关。

根据既往的临床工作积累推测，LVNC 患者已经存在的致密层心肌纤维化，并在此基础上出现心脏重构，可能是导致疾病进展的使动因素。LVNC的临床表现多样，预后不同，可能因为目前多种诊断标准主要基于不同心脏平面非致密化心肌与致密化心肌的厚度之比来进行形态学诊断，但这些诊断标准无心肌组织特征，无运动功能评价，无生物学诊断内容[10]，Kohli 等[11]研究发现，在无心脏疾病的受试者中有8%的人群满足目前LVNC 的超声心动图诊断标准。在影像学表现类似的患者中，致密层的组织学改变尤其应该受到重视。LVNC 患者多数存在致密层厚度减少，但是鲜有研究探索致密层的组织学改变。本研究结果中LVNC 患者致密层心肌的Native T1 值显著高于健康对照组，提示致密层心肌存在纤维化，这与既往研究一致[12]。

心肌Native T1 值可以直观反映心肌组织病变异常程度，Native T1 mapping 是近些年新发展起来的用于评估心肌组织特征的一项新技术，可以提高疾病的诊断水平、判断疾病的受累程度及潜在的预后。Native T1 参数是指组织的T1 常数经过展缩编码到对应的图像区域的灰度值中，用来衡量组织成分的变化[4-5]。它不需要钆对比剂，适用于肾功能异常及对比剂过敏的患者[13]。目前Native T1 mapping 已被应用于扩张型心肌病[14]、肥厚型心肌病[15]和急性心肌梗死[16-17]等疾病中，用于评价心肌纤维化病变程度，并且有研究发现在评价心肌纤维化方面优于钆对比剂延迟强化（LGE）技术，Native T1 mapping 在检测心肌纤维化方面与心肌活检有较高的一致性。同时有研究显示Native T1 mapping 作为一种可量化的技术，可以用于疾病活动的分级、监测进展和指导治疗。Native T1 mapping 弥补了LGE 对弥漫性心肌纤维化识别不足的缺点，比LGE 更加敏感，能早期发现心肌病变。尽管心肌活检是目前检测心肌纤维化的“金标准”，但为有创检查，并发症风险较大，且受标本取材的局域性影响，患者难以接受等，不能作为临床工作中的常规检查，因此目前Native T1 mapping 被认为是比心肌活检更为优越的无创检测心肌纤维化的方法。

为探索致密层心肌的组织学改变是否会伴随一定程度的心肌重构，本研究对LVNC 患者外周血MMP-9 的水平进行了定量分析，发现LVNC 患者的MMP-9 mRNA 水平及蛋白水平均显著高于健康对照组，与既往很多研究结果一致[18-19]。MMP-9 在许多心血管疾病中参与了心肌重构的过程，MMP-9 上调导致了与内源性MMP 抑制物失衡，造成了细胞外基质合成与降解的动态平衡被打破，细胞外基质沉积，进一步导致炎症细胞的聚集，炎症细胞分泌一些细胞因子及生长因子，从而又加剧了心肌重构的进程[20]。

同时本组研究结果发现，MMP-9 蛋白水平与致密层心肌Native T1 值正相关，意味着在致密心肌出现纤维化的同时，已经伴随出现了心肌重构。心肌重构的原因一方面可能来自于先天的心肌发育障碍，但同时也有可能是因为合并了导致或者加重心肌重构的伴随因素。在临床中我们也观察到不少具有LVNC 表型的患者，在一定的诱因情况下出现严重的心力衰竭甚至心室内血栓形成，尤其在具有家族史的患者中更为明显，经过积极治疗后这些患者的心功能可以全部或者部分恢复，这意味着LVNC 患者更容易受到诱因影响，导致心力衰竭，因此对于具有LVNC 表型的患者控制心血管危险因素如高血压、糖尿病、容量负荷过重和病毒感染等非常重要，而这些危险因素往往也是导致心室重构的重原因。

本研究是一个小样本的探索性研究，样本量虽小，初步证实了LVNC 患者致密层心肌改变可能与心肌重构指标相关，需在更大规模和长期随访中进一步明确致密层T1 mapping 数值评估预后的阈值。Native T1 mapping 也有一定局限性，例如易受一些参数的影响，如机器方面，不同厂家、不同型号的机器标准值均不一样，同时标准值受磁场影响也较大；另外，Native T1 值也受患者的自身生理参数如心率、红细胞压积等因素影响[5]。未来将进一步研究，采用细胞外容积比（ECV）方法减轻其局限性。

总之，LVNC 患者致密层心肌Native T1 值显著增高，且与血清中MMP-9 的表达有较高的一致性，提示LVNC 患者致密层心肌的组织学改变与心肌重构可能有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突