猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用

周新宇，陈鑫鑫，乔松林，郭振华，李 睿，邓瑞广，张改平

(1.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450002； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以妊娠母猪发生流产、木乃伊胎、死胎及弱胎等繁殖障碍以及仔猪与育肥猪呼吸道疾病为主要特征的病毒性传染病[1-2]，该病在全球范围内传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约15 kb，含有10个开放阅读框[3-4]。ORF1a和ORF1b分别编码pp1a和pp1ab多聚蛋白，pp1a和pp1ab分别被酶切裂解为至少16种非结构蛋白[5-6]。其中，非结构蛋白Nsp2是不同毒株基因组差异最大的区域[7]。2006年，我国暴发了由高致病性PRRSV(High pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)引发的以高热、高发病率和高死亡率为特征的PRRS疫情，HP-PRRSV在Nsp2蛋白序列中存在30个氨基酸的不连续缺失[8-9]；2012年，我国报道了与PRRSV经典毒株NADC30核苷酸相似性很高的毒株,命名为类NADC30毒株(NADC30-like strain)，其在Nsp2蛋白上存在131个氨基酸的不连续缺失[10-11]。自2013年以来，类NADC30毒株检测率急剧上升，并且类NADC30毒株与其他田间毒株重组频繁，迅速成为河南省乃至全国的优势流行毒株[12-14]。

PRRSV的检测方法有很多种，包括病毒分离和鉴定、ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、血清中和试验(SN)、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等方法[15-16]。但在实际的生产应用中，大部分方法只能检测而无法区分不同PRRSV毒株。运用荧光定量PCR技术和基因测序等分子生物学技术是目前鉴别检测PRRSV最有效的方法[17]，根据Nsp2基因序列建立的荧光定量PCR检测方法是目前用于区分PRRSV不同毒株的主要方法。鉴于此，基于不同毒株Nsp2基因序列缺失差异[18]，针对以HP-PRRSV毒株JXA1为亲本得到的疫苗株JXA1-R和河南省滑县采集样品中新分离鉴定的类NADC30毒株HNhx基因序列[19]，以期建立能够检测区分疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx的TaqMan荧光定量PCR方法和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，旨在为PRRSV的快速鉴别检测提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 病毒及模板

PRRSV疫苗株JXA1-R购自普莱柯生物工程股份有限公司；类NADC30毒株HNhx(GenBank No.KX766379.1)由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室分离保存。猪流行性腹泻病毒(PEDV)cDNA、塞尼卡病毒(SVA)cDNA、猪伪狂犬病毒(PRV)DNA、猪圆环病毒2型(PCV2)DNA和非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72基因质粒均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存。

1.2 主要试剂

TRIzol LS试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix、ExTaqDNA聚合酶、JM109感受态细胞、pMD 20-T载体和Premix ExTaq(Probe qPCR)试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司；SYBR Green Master购自Roche公司；质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3 引物和探针设计合成

应用MegAlign软件对PRRSV JXA1-R株和HNhx株的Nsp2基因序列进行分析，运用NCBI中在线软件Primer-BLAST分别设计引物，并根据探针设计原则设计探针，用Oligo 7软件评估探针。通过对修饰基团分析，选择FAM和CY-5作为探针5′端标记的荧光报告基团，针对荧光报告基团选择BHQ-1和BHQ-2作为3′端标记的荧光淬灭基团。本研究使用的引物和探针(表1)均由生工生物(上海)股份有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取和cDNA合成

用TRIzol LS分别提取待检样品、疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx的总RNA，按照TRIzol LS说明书，分别用TRIzol LS裂解样品，再用氯仿分离有机相和水相，异丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗涤，最后用RNase free dH2O溶解，测定RNA浓度。按照PrimerScript RT Master Mix 操作步骤，以20 μL的反转体系为准，反转录得到cDNA。

1.5 标准质粒的制备

根据疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx的Nsp2序列，利用表1中克隆引物JXA1-R和HNhx分别进行普通PCR扩增，连接到pMD 20-T载体，转化至JM109感受态细胞，挑选阳性重组克隆，进行测序鉴定。构建的重组质粒测定浓度并计算拷贝数，作为荧光定量PCR的标准品。

表1 引物及探针序列Tab.1 Sequences of primers and probes

1.6 标准曲线的建立

以10倍系列倍比稀释质粒标准品103～109拷贝/μL，分别取2 μL作为荧光定量PCR的模板进行扩增，每个梯度设3个重复。对于探针法，经优化确定20 μL最佳反应体系：Premix ExTaq(2×)10 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.2 μL，引物0.6 μL，探针0.1 μL，模板2 μL，RNase free dH2O补至20 μL;反应条件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。对于SYBR Green Ⅰ方法，经优化20 μL反应体系：SYBR Green Master(2×)10 μL，引物1 μL，模板2 μL，RNase free dH2O补至20 μL；反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40个循环。使用ABI 7500 Fast Real-time PCR System进行荧光定量PCR检测，生成标准曲线。

1.7 敏感性试验

将质粒标准品按10倍倍比稀释，以每个稀释度的标准品为荧光定量PCR模板，同时设仅加水的阴性对照组，以确定建立方法可检测到的最低拷贝数。

1.8 重复性试验

选取JXA1-R株和HNhx株不同拷贝数的标准品分别进行3组批内和批间重复，并计算批内和批间的标准差及变异系数，以评估建立方法的稳定性。

1.9 特异性试验

以PEDV、SVA、PRV、PCV2、ASFV的基因组为模板，以JXA1-R株和HNhx株的cDNA为阳性对照，同时设仅加水的阴性对照，进行荧光定量PCR检测，以检测建立方法的特异性。

1.10 样品检测

所检血清样品来源于以下处理：将PRRSV阴性仔猪12头随机分为A、B、C 3组，A组接种疫苗株JXA1-R，B组接种PBS，C组不做处理；仔猪7日龄时，A组和B组均接种类NADC30毒株HNhx，C组不做处理。攻毒后15 d，采集血清样品进行检测。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR标准质粒的制备

利用克隆引物经过PCR扩增分别获得Nsp2区JXA1-R株307 bp和HNhx株266 bp片段(图1)，将目的基因片段连接到pMD 20-T载体上，作为标准质粒对照。重组质粒经过测序鉴定，并测定其DNA含量：JXA1-R株为2 244.32 ng/μL，HNhx株为2 421.23 ng/μL，计算拷贝数后作为荧光定量PCR的标准品稀释使用。

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立

将2.1中针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍系列稀释后作为模板，根据反应条件进行荧光定量PCR，生成扩增曲线和标准曲线(图2和图3)，对应的扩增曲线呈现出显著的S形，对应的标准曲线R2均达到0.990以上。

2.3 荧光定量PCR敏感性试验

将针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍倍比稀释，使标准品浓度依次为101～1010拷贝/μL，进行TaqMan荧光定量PCR检测，结果如图4所示。JXA1-R株和HNhx株的检出下限分别为104拷贝/μL 和103拷贝/μL，对应的循环数分别约为33.67个和35.59个。根据阴性对照及3次重复试验结果，最终确定判定标准：对JXA1-R株，当循环数≤33时，可以判定为阳性，当循环数≥34时，判定为阴性，当33<循环数<34时，判定为可疑；对HNhx株，当循环数≤35时，可以判定为阳性，当循环数≥36时，判定为阴性，当35<循环数<36时，判定为可疑。

将针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍倍比稀释，使标准品含量依次为101～108拷贝/μL，进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测，结果如图5所示。JXA1-R株和HNhx株的检出下限均为102拷贝/μL，对应的循环数分别约为36.34个和36.94个，此时阴性对照对应的循环数分别约为35.92个和36.02个。根据阴性对照及3次重复试验结果，最终确定判断标准：对于JXA1-R株和HNhx株，当循环数≤35时，可以判定为阳性，当循环数≥36时，判定为阴性，当35<循环数<36时，判定为可疑。

2.4 荧光定量PCR方法的稳定性分析

将针对JXA1-R株和HNhx株的3份拷贝数不同的标准品进行3组批内和批间重复，根据循环数进行分析，其变异系数均小于1.5%(表2)，表明建立的Taq Man荧光定量PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法均具有良好的稳定性。

2.5 荧光定量PCR方法的特异性检测

利用建立的荧光定量PCR方法对PEDV和SVA的cDNA、PRV和PCV2的DNA、ASFV的质粒进行检测，结果如图6和图7所示。阳性对照出现特异性扩增，其他样品检测结果均为阴性，表明建立的方法具有良好的特异性。

表2 荧光定量PCR检测3份不同拷贝数样品的批内和批间检测结果Tab.2 Intra-assay and inter-assay reproducibility of fluorescent quantitative PCR

2.6 血清样品检测

利用建立的荧光定量PCR对动物试验各组采集的血清样品进行检测，检测结果见表3。由表3可知，A组JXA1-R、HNhx检测均为阳性，B组HNhx检测阳性。可见，建立的荧光定量PCR方法可有效检测疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx。

TaqMan荧光定量PCR探针法可同时在一个反应体系中进行JXA1-R株和HNhx株的检测(图8)，若待检样品中同时含有JXA1-R株和HNhx株，FAM和CY5两种探针都呈现出扩增曲线；若待检样品中只含有HNhx，只有CY5探针具有扩增曲线。而SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR需要分别检测待检样品中JXA1-R株和HNhx株。

表3 荧光定量PCR对样品的检测结果Tab.3 Detection of samples by fluorescent quantitative PCR

3 结论与讨论

PRRSV自1987年在美国发现以来，每年给世界养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV具有高度变异的特征，其进化速度远远高于其他RNA病毒[20]。2014—2019年，中国类NADC30毒株检出率已高达60%左右[13]。类NADC30毒株与我国本土流行毒株极易发生基因重组[14,21]，其在流行毒株中所占比例急剧上升成为优势毒株[22-23]。荧光定量PCR由于其简单、稳定、快速以及准确的特点[24]，现已经成为实验室检测PRRSV的主要方法之一。常用的荧光定量PCR方法主要是TaqMan探针法和SYBR Green Ⅰ荧光染料法。本试验通过对JXA1-R疫苗株和类NADC30毒株HNhxNsp2基因序列进行比对，找出各自缺失区域，分别设计特异性引物和探针，成功建立TaqMan荧光定量PCR方法和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，可以对PRRSV疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx进行鉴别检测，且与其他猪病病毒无交叉反应。使用此方法对人工感染仔猪临床样品进行检测，可以有效地检测血清样本。

此外，本试验对建立的TaqMan荧光定量PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 2种方法进行分析比较，结果表明，2种荧光定量PCR方法都可以对PRRSV JXA1-R疫苗株和类NADC30毒株HNhx进行鉴别检测。TaqMan荧光定量PCR方法中荧光探针的加入使特异性增强，可以同时鉴别检测JXA1-R疫苗株和类NADC30毒株HNhx，节省了时间。但可能由于特异性引物和探针均需针对Nsp2各基因序列缺失区域设计，探针的保守性及设计要求使得针对基因的设计范围非常有限，其敏感性有所降低；而SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法只需考虑特异性引物的保守性及设计要求，针对基因的设计范围相对较广，进行优化后所建立的方法敏感度较高。

综上，本研究成功建立了能够有效区分PRRSV JXA1-R疫苗株和类NADC30毒株HNhx的2种荧光定量PCR方法，为PRRSV的鉴别检测提供一定的技术参考。