槲皮苷通过Nrf2/HO-1通路抑制H2O2诱导人肝细胞L-02凋亡和损伤

吕莹，郝尧坤，张照兰（河南中医药大学第一附属医院 脾胃肝胆病科，郑州 450000）

细胞凋亡是程序性细胞死亡，具有坏死的生化和形态学特征，细胞凋亡不仅可能导致细胞死亡，而且在导致受损组织的级联反应中起重要作用[1]。肝细胞凋亡是肝脏疾病的重要影响因素，并参与正常肝细胞的发育和控制肝脏疾病的发展[2]。槲皮苷（quercitrin），即槲皮素-3-鼠李糖苷，具有较强的抗氧化作用，是一种遍布植物体内的生物大分子，为侧柏[3]、鱼腥草[4]、桑寄生[5]等传统中药材的主要药物成分，其药效作用备受人们的重视。近几年研究发现槲皮苷发挥多种生物学作用，包括抗肿瘤[6]、抑制破骨细胞形成[7]、保护血管内皮细胞[8]、促进牙周再生[9]、抑制巨噬细胞炎症[10]等。本实验采用过氧化氢（H2O2）处理肝细胞损伤进行体外实验研究，观察槲皮苷对肝细胞L-02 损伤的保护作用和抗凋亡机制。

1 材料

正常人肝细胞L-02（中国科学院上海细胞生物学研究所），槲皮苷（纯度≥98%）、7'-dichloroflurescin diacetate（DCFH-DA）试剂盒（美国Sigma-Aldrich 公司），噻唑蓝（MTT）（货号：M2128）、二甲基亚砜（DMSO）、DMEM 培养基、胎牛血清（美国GIBCO 公司），异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒（货号：KGA108）（江苏凯基生物公司），核转录因子E2 相关因子（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase-3）抗体（美国Cellular Signaling Technology 公司），辣根过氧化物酶标记二抗（北京中杉金桥有限公司），TNF-α（货号：E-EL-H0109c）、IL-6（货号：E-ELH0102c）酶联免疫（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）（货号：S0109）、丙二醛（MDA）（货号：S0131）检测试剂盒（碧云天生物技术公司）。

2 方法

2.1 L-02 细胞培养与分组

L-02 细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中常规培养。将生长状态良好的L-02 细胞分为空白组：正常培养的L-02 细胞；H2O2组：使用0.6 mmol·L－1H2O2处理1 h；槲皮苷处理组：L-02细胞分别使用25、50、100、200、400、800、1600、3200 μmol·L－1槲皮苷预处理3 h 后，使用0.6 mmol·L－1H2O2处理1 h，收集细胞，进行后续实验。于倒置显微镜下观察细胞形态变化。

2.2 MTT 检测L-02 细胞增殖

各组L-02 细胞接种于96 孔板中，密度为1×105个·mL－1，培养48 h 后，每孔细胞加入5 mg·mL－1的MTT 溶液20 μL，37℃培养4 h，加入DMSO 150 μL，37℃摇床振荡培养10 min，于酶标仪测定L-02 细胞在490 nm 处的吸光（OD）值，细胞存活率（%）＝实验组OD值/对照组OD值×100%。

2.3 DAPI/PI 检测L-02 细胞凋亡

各组L-02 细胞培养24 h（接种密度1×105个·mL－1），加入多聚甲醛固定，用DAPI 和PI染液染色15 min，染色后，加入甲醇洗涤，弃去甲醇，于荧光显微镜下观察细胞核染色情况，进行DAPI/PI 双染细胞计数并计算细胞凋亡率。

2.4 流式细胞术检测L-02 细胞凋亡

L-02 细胞密度调整为1×106个·mL－1，参照细胞凋亡率检测试剂盒说明书的步骤，使用500 μL 缓冲液悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 5 μL 混匀，加入PI 5 μL 混匀，室温遮光反应15 min，置流式细胞仪检测L-02 细胞凋亡。

2.5 氧化应激指标ROS、SOD 和MDA 的检测

收集各组L-02 细胞上清液，分别按照ROS、SOD 和MDA 的检测试剂盒说明书的步骤进行检测。

2.6 ELISA 法检测炎症因子TNF-α 和IL-6 水平

收集各组L-02 细胞上清液，按照ELISA 试剂盒说明书检测TNF-α和IL-6 水平。

2.7 Western blot 检测Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 蛋白表达

使用RIPA 裂解液提取各组L-02 细胞的总蛋白，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入目的蛋白一抗（Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 均为1∶1000 稀释），4℃孵育过夜，次日用Tris-HCl-Tween 缓冲盐溶液（TBST）洗膜10 min×3次，加入二抗（1∶800稀释），室温孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，显色、曝光，以β肌动蛋白（β-actin）作为内参蛋白，分析目的蛋白表达。

2.8 统计学分析

数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，结果以平均值±标准差（±s）表示。多组间数据比较用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02存活率的影响

与空白组比较，H2O2处理后人肝细胞L-02 存活率降低；与H2O2组比较，50 ～1600 μmol·L－1的槲皮素增加人肝细胞L-02 存活率，3200 μmol·L－1的槲皮素促进H2O2诱导人肝细胞L-02存活率降低（见表1）。其中槲皮苷100、200、400 μmol·L－1条件下的H2O2处理后人肝细胞L-02 存活率相对较高，800 μmol·L－1浓度下的存活率与100 μmol·L－1浓度差异不大，故选用槲皮苷100、200、400 μmol·L－13 个浓度进行后续实验。

3.2 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 凋亡的影响

肝细胞形态学观察显示，与空白组比较，H2O2处理后人肝细胞L-02 膜粗糙，部分膜破裂，透光度低；与H2O2组比较，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1浓度组细胞形态明显得到改善。DAPI 进行细胞核染色显示，与空白组（2.15±0.46）%比较，H2O2处理的L-02 染色质浓缩、凝聚、断裂，细胞凋亡（27.46±3.67）%显著增多（P＜0.05）。与H2O2组比较，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1浓度组[（22.12±2.88）%、（16.87±2.34）%、（13.34±1.72）%]细胞凋亡显著减少。其中槲皮苷 400μmol·L－1效果最佳（见图1）。

表1 不同浓度的槲皮苷对H2O2 处理肝细胞L-02 增殖的影响(± s，n ＝9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

表1 不同浓度的槲皮苷对H2O2 处理肝细胞L-02 增殖的影响(± s，n ＝9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

注：与空白组比较，*P ＜0.05；与H2O2 组比较，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

组别 细胞存活率/%空白组 100.84±3.13 H2O2 组 59.29±3.71*H2O2 ＋槲皮苷25 μmol·L－1 组 62.05±4.75 H2O2 ＋槲皮苷50 μmol·L－1 组 68.88±5.86#H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 组 73.12±4.63#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 组 77.44±5.26#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 组 84.19±3.44#H2O2 ＋槲皮苷800 μmol·L－1 组 74.08±3.35#H2O2 ＋槲皮苷1600 μmol·L－1 组 66.39±3.11#H2O2 ＋槲皮苷3200 μmol·L－1 组 52.21±4.34#

3.3 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 凋亡和凋亡蛋白的影响

与空白组比较，H2O2诱导的人肝细胞L-02凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表达量明显升高，Bcl-2 蛋白水平显著降低，Bax/Bcl-2 比率显著升高（P＜0.05，见表2和图2）。与H2O2组比较，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明显减少H2O2诱导的人肝细胞L-02 凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表达量，显著提高Bcl-2 蛋白水平，降低Bax/Bcl-2 比率，并呈浓度依赖性（P＜0.05，见表2和图2）。

3.4 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 氧化应激的影响

与空白组比较，H2O2处理后人肝细胞L-02 中ROS 含量和MDA 水平显著升高，SOD 活性明显降低（P＜0.05，见表3）。与H2O2组比较，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明显降低H2O2损伤的L-02 细胞的ROS 和MDA 水平，显著提高SOD 活性，并呈浓度依赖性（P＜0.05，见图3和表3）。

3.5 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 炎症因子分泌的影响

与空白组比较，H2O2组人肝细胞L-02 中TNF-α和IL-6 水平显著升高（P＜0.05）。与H2O2组比较，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明显降低H2O2处理的人肝 细 胞L-02 的TNF-α和IL-6 水平，并呈浓度依赖性（P＜0.05，见表4）。

3.6 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 Nrf2/HO-1 通路的影响

图1 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 凋亡的影响（DAPI，×200）Fig 1 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 treated with H2O2 （DAPI，×200）

图2 槲皮苷对人肝细胞L-02 凋亡（A）和凋亡相关蛋白表达（B）的影响Fig 2 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 （A）and expression of apoptosis-related proteins（B）

图3 探针法检测人肝细胞L-02 中ROS 荧光强度（×100）Fig 3 Fluorescence intensity of human hepatocyte L-02 ROS detected by probe method（×100）

与空白组比较，H2O2处理人肝细胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与H2O2组比较，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1浓度组Nrf2 和HO-1 蛋白水平显著升高，并呈浓度依赖性（P＜0.05，见图4及表5）。

4 讨论

表2 槲皮苷对H2O2 处理肝细胞L-02 凋亡和凋亡相关蛋白表达的影响(x±s，n ＝9)Tab 2 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 apoptosis and apoptosis-related protein expression (x±s，n ＝9)

表3 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 中ROS 荧光强度、SOD 和MDA 水平的影响(± s，n ＝9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity，SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

表3 槲皮苷对H2O2 处理人肝细胞L-02 中ROS 荧光强度、SOD 和MDA 水平的影响(± s，n ＝9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity，SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

注：与空白组比较，*P ＜0.05；与H2O2 组比较，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

组别 ROS 荧光强度（UFI） SOD 活性/（U·mL－1） MDA 含量/（μmol·L－1）空白组 493.38±78.83 32.40±1.26 2.34±0.67 H2O2 组 1305.59±102.80* 11.31±1.77* 9.57±0.85*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 组 1155.47±92.73# 16.98±1.35# 6.23±0.63#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 组 989.52±82.12# 21.34±1.49# 5.36±0.47#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 组 795.65±73.40# 24.55±1.18# 4.62±0.59#

表4 槲皮苷对H2O2 诱导的人肝细胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影响(± s，n ＝9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s，n ＝9)

表4 槲皮苷对H2O2 诱导的人肝细胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影响(± s，n ＝9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s，n ＝9)

注：与空白组比较，*P ＜0.05；与H2O2 组比较，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

组别 TNF-α 含量/（ng·L－1）IL-6 含量/（ng·L－1）空白组 16.54±2.92 10.26±1.05 H2O2 组 52.33±5.45* 26.64±3.08*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 组 44.65±4.03# 22.15±2.60#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 组 37.25±4.68# 20.56±2.23*H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 组 31.06±3.97# 15.22±2.18#

图4 槲皮苷对人肝细胞L-02 Nrf2/HO-1 蛋白表达的影响Fig 4 Effect of quercetin on the expression of L-02 Nrf2/HO-1 proteins in human hepatocytes

在肝细胞损伤过程中，ROS 与细胞内大分子（蛋白质、核酸、脂质等）以及细胞膜、细胞器结合破坏其生物活性，诱发肝细胞凋亡，在多种肝脏疾病发生起重要作用[11]。目前关于肝细胞氧化应激损伤的病理机制尚未完全阐明，既往研究显示抑制肝细胞氧化应激损伤及肝细胞凋亡可有效保护肝细胞免受氧自由基损伤[12-13]，本研究主要探讨槲皮苷对肝细胞H2O2损伤的作用机制，为研发抗H2O2损伤的新型药物提供新方向。

表5 槲皮苷对H2O2 处理肝细胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表达的影响(± s，n ＝9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s，n ＝9)

表5 槲皮苷对H2O2 处理肝细胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表达的影响(± s，n ＝9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s，n ＝9)

注：与空白组比较，*P ＜0.05；与H2O2 组比较，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

组别 Nrf2 蛋白 HO-1 蛋白空白组 0.21±0.02 0.14±0.02 H2O2 组 0.33±0.04* 0.24±0.03*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 组 0.45±0.03# 0.41±0.05#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 组 0.49±0.06# 0.46±0.05#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 组 0.66±0.07# 0.71±0.07#

槲皮苷具有抗氧化、抗炎和改善药物代谢等作用，国内外研究显示槲皮苷通过降低ROS 含量和细胞毒性发挥细胞保护作用[14]。细胞凋亡过程受到多种基因调控，研究表明caspase-3 可参与肝细胞凋亡过程，活化成Cleaved caspase-3 时可发挥促进细胞凋亡的作用[15-16]。本研究通过使用H2O2处理L-02 细胞模拟其在体内环境，细胞增殖率降低，Cleaved caspase-3、Bax 的蛋白水平升高，Bcl-2 的蛋白水平降低，细胞凋亡率升高；槲皮苷可促进细胞存活，抑制H2O2诱导L-02 细胞凋亡，降低Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表达量，升高Bcl-2 蛋白水平。

机体在应对氧自由基损害时，形成完善的氧化应激应答防御系统，该系统受抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）位于抗氧化保护基因的上游调控区域调控[17]。氧化应激是肝细胞损伤的重要原因之一，细胞发生氧化应激时ROS 水平升高，可加重肝细胞凋亡，MDA是一种脂质过氧化产物，细胞发生氧化应激时促使MDA 水平升高从而进一步加重氧化应激损伤，SOD 属于抗氧化酶类且具有清除氧自由基能力[18-20]。研究表明，IL-6、TNF-α水平降低可减轻体内炎症反应从而减弱细胞损伤程度[21]。本研究发现槲皮苷可显著升高SOD 活性，降低ROS、MDA、TNF-α、IL-6 水平。

Nrf2/HO-1 途径是参与机体氧化应激调控的重要信号通路，ROS 的大量产生可刺激Nrf2 表达，促进下游HO-1 等抗氧化基因表达进而增强细胞抗氧化应激能力[22-23]。Nrf2/HO-1 途径已被证实在H2O2诱导的肝细胞中激活，其激活是启动细胞内源性抗氧化途径之一[24]。本研究发现槲皮苷处理组Nrf2 和HO-1 表达水平显著高于H2O2，提示槲皮苷可能通过激活Nrf2/HO-1 途径进而对H2O2诱导L-02 细胞损伤发挥保护作用。

综上所述，研究表明槲皮苷对H2O2损伤的肝细胞具有保护作用，抑制肝细胞凋亡，其机制可能为槲皮苷通过抑制H2O2引起的氧化应激和炎症因子分泌，与Nrf2/HO-1 通路激活密切相关。