一株野生巨大口蘑新菌株的培养条件研究

张振伟 周伟坚 马紫英 倪 焱 杨水莲 莫美华

（华南农业大学食品学院，广东广州510642））

巨大口蘑（Macrocybe gigantea）属担子菌门（Basidiomycota）、伞 菌 纲（Agaricomycetes）、伞 菌 目（Agaricales）、白蘑科（口蘑科）（Tricholomataceae）、大杯伞属（Macrocybe）的一种珍稀食药用菌，异名洛巴伊口蘑（Tricholoma lobayense）、大白口蘑（Tricholoma spectabilis）[1]。巨大口蘑属高温食用菌，自然界主要分布在热带和亚热带地区，在我国的广西、广东、福建、湖南、台湾等省（区）均有分布[2]。巨大口蘑子实体硕大，外形优美，不易开伞，菌肉致密，口感鲜嫩爽脆，并且含有丰富的粗多糖、粗纤维、粗蛋白和矿质元素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗高血压及提高免疫力等多种功效[3-8]。2009 年9月莫美华等在广东省广州市东莞庄路采集到一株野生巨大口蘑菌株并将其命名为新1（菌株号dongguanzhuang），其 ITS 序列已提交 NCBI（美国国家生物技术信息中心）。试验对该菌株菌丝培养条件进行探索，以期为该菌株驯化栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

巨大口蘑菌株dongguanzhuang（以下称新1菌株，ITS 序列NCBI 编号：JX068527），由野外采集（图1），采用组织分离法分离纯化得到其菌丝体。

1.2 试验培养基[9-10]

培养基1：马铃薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.15%，MgSO40.05%，琼脂2%。

培养基2：葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.15%，MgSO40.05%，琼脂2%。

培养基3：葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，琼脂2%。

培养基4：葡萄糖2%，硝酸钠0.2%，琼脂2%。

1.3 试验方法

1.3.1 培养温度试验[11-12]

试验采用培养基1，pH 自然。培养温度分别为24.0 ℃、26.0 ℃、28.0 ℃、30.0 ℃、32.0 ℃、34.0 ℃。观察不同培养温度对新1 菌株菌丝生长（以下称菌丝生长）的影响。每个处理设5个重复。

1.3.2 pH试验[13]

试验采用培养基2。培养基pH 分别调为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接种后于30 ℃恒温培养箱中培养。观测不同pH 对菌丝生长的影响。每个处理设5 个重复。

1.3.3 碳源试验[11]

分别以可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖作为培养基2中的碳源，并设不外加碳源的培养基为对照组。接种后置30 ℃恒温培养箱中培养，观察不同碳源培养基上菌丝生长情况。每个处理设5个重复。

1.3.4 氮源试验[11-12，14]

分别以硝酸钠、酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、牛肉膏作为培养基2 氮源，并设不含外加氮源的培养基为对照组。接种后置30 ℃恒温培养箱中培养，观察不同氮源培养基上菌丝生长情况。每个处理设置5个重复。

1.3.5 无机盐试验[12，15]

在培养基3 中分别添加供试无机盐ZnSO4、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、KCl、FeSO4。加入KH2PO4的质量浓度（g/L）为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0；加入MgSO4、KCl、CaCl2的质量浓度（g/L）为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5；加入ZnSO4、FeSO4的质量浓度（g/L）为 0.02、0.06、0.10、0.14、0.18。对照组不添加无机盐。接种后于30 ℃恒温培养箱中培养，观察不同浓度无机盐对菌丝生长的影响。每个处理设置5个重复。

1.3.6 维生素试验

在培养基4 中分别加入质量浓度（mg/L）为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0的叶酸、烟酸、VB6、VB1、VB2、泛酸、VC（采用过滤除菌法在添加维生素的过程中除菌，滤菌器孔径为0.22 μm），对照组不添加维生素。接种后于30 ℃恒温培养箱中，观察不同质量浓度维生素对菌丝生长的影响。每个处理设置5个重复。

1.3.7 接种及测定方法[16]

无菌环境中，用圆形打孔器打取菌块接种至试验平板培养基中心，于恒温培养箱中培养。每隔72 h 测量一次菌落直径并记录菌丝的生长势，计算菌丝的平均生长速度。

2 结果与分析

2.1 培养温度对新1菌株菌丝生长的影响

由表1可知，培养温度为26～34 ℃，新1菌株菌丝均可生长（以下称菌丝生长），培养温度为30 ℃时菌丝平均长速最快，但与培养温度为28 ℃、32 ℃无显著差异。培养温度为24 ℃时，菌丝生长缓慢，且长势稀。

表1 试验培养温度对新1菌株菌丝生长的影响

2.2 pH对新1菌株菌丝生长的影响

由表2 可知，在pH 5～8 培养基上菌丝平均生长速度差异不显著，但pH 6、pH 7 培养基上菌丝长势最为浓密。

2.3 供试碳源对新1菌株菌丝生长的影响

由表3可知，在所有供试碳源培养基、对照培养基上菌丝均可生长，在碳源为果糖的培养基上菌丝平均长速最快，长势浓密。在碳源为蔗糖的培养基上菌丝平均长速其次，与果糖为碳源的培养基相比有显著的差异。在碳源为乳糖的培养基上菌丝平均长速最慢，长势较浓密。

2.4 供试氮源对新1菌株菌丝生长的影响

由表4 可知，在不同氮源的培养基上新1 菌株菌丝生长存在较大的差异。新1菌株菌丝在以牛肉膏或酵母膏为氮源的培养基上平均长速最快，并且两者没有显著的差异，菌丝长势也浓密。在氮源为蛋白胨的培养基上新1 菌株菌丝平均长速其次，长势较浓密。在氮源为NaNO3或（NH4）2SO4的培养基上新1 菌株菌丝平均长速较慢，长势稀。在氮源为尿素的培养基上新1菌株菌丝不能生长。

表4 不同氮源对新1菌丝生长的影响

2.5 供试无机盐对新1菌株菌丝生长的影响

由图2 可知，随着培养基中添加KH2PO4质量浓度的上升，新1菌株菌丝生长受到显著的抑制。

图2 KH2PO4对新1菌株菌丝生长的影响

由图3 可知，添加质量浓度为0.5 g/L 的MgSO4对新1 菌株菌丝生长有显著的抑制作用；加入质量浓度为0.5 g/L 的KCl也对新1菌株菌丝生长有显著影响；质量浓度为1.0 g/L或高于该浓度的CaCl2对新1菌株菌丝生长有显著的抑制作用。

由图4 可知，添加质量浓度为0.1 g/L 或高于该浓度的ZnSO4，添加质量浓度为0.06 g/L 或高于该浓度的FeSO4均对新1 菌株菌丝的生长有显著的抑制作用。

图3 无机盐（MgSO4、KCl、CaCl2）对新1菌株菌丝生长的影响

图4 无机盐（ZnSO4、FeSO4）对新1菌株菌丝生长的影响

2.6 维生素对新1菌株菌丝生长的影响

由图5、图6、图7 可知，培养基加入一定质量浓度的维生素 B1（VB1）、烟酸、泛酸、叶酸、维生素 C（VC）对新1 菌株菌丝生长无显著影响；加入质量浓度为2 mg/L 或高于该浓度的维生素B6（VB6）对新1菌株菌丝生长有显著促进作用。

图5 维生素（VB1、VB2、VB6）对新1菌株菌丝生长的影响

图6 维生素（烟酸、泛酸）对新1菌株菌丝生长的影响

图7 维生素（叶酸、VC）对新1菌株菌丝生长的影响

3 小结与讨论

试验结果表明，新1 菌株菌丝生长适宜的温度为28～32 ℃，最适温度为 30 ℃；培养基适宜 pH5～8，最适pH 为6，最适碳源为果糖，最适氮源为牛肉膏、酵母膏，在此条件下新1 菌株菌丝生长速度快且长势旺盛、浓密。较高浓度的无机盐对菌丝生长均有显著的抑制作用，维生素B2、维生素B6对菌丝生长有显著促进作用，维生素B1、烟酸、泛酸、叶酸、维生素C对菌丝生长没有显著性影响。

试验培养基加入0.18 g/L FeSO4时，新1 菌株仍然能生长，但菌丝稀。分析出现异常的可能原因：一是接种时虽然选取了在相同条件下培养的同一批次菌种，但是由于菌丝发育的个体差异，不排除不同平板培养基上的菌种对无机盐的耐受性存在细微的差别，导致菌丝在高浓度无机盐平板上有少量生长；二是培养箱的不同空间位置可能造成培养温度等条件存在细微差异；总体来讲，高浓度无机盐抑制新1菌株菌丝生长，个别处理出现轻微异常可能需要进一步规范试验操作、减少系统误差来消除。

巨大口蘑作为一种品质优良的食用菌，具有较高的推广栽培价值，但目前对其生物学特性和栽培条件的研究还较少。研究结果对野生巨大口蘑新1菌株推广具有一定参考价值。