血清miRNA-182联合癌胚抗原对胃癌的诊断效能及临床意义

朱 敏，崔德军，叶丽敏，李 宇，袁 芳

0 引 言

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，居全世界癌症死因的第2位，大多数患者确诊时已处于进展期，预后较差[1]。肿瘤指标癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是临床上常用于筛查肿瘤的指标。有研究报道，CEA单独诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为66.7%和61.4%[2]。因此，具有高灵敏度和高特异性的肿瘤标志物对胃癌的诊断及治疗有重要的意义。微小RNA(miRNA)是一种广泛存在于真核生物细胞中的小分子RNA，可参与肿瘤的发生、发展，并与肿瘤的预后密切相关。miRNAs可稳定存在于血浆或血清中。miRNAs可能有助于阐明肿瘤生长的机制及发现早期检测胃癌的有效标志物[3-4]。有研究发现，miRNA-182在胃癌组织中的表达增高且其高表达提示了病情进展及不良预后[5]；然而Kong等[6]研究发现miRNA-182在人胃腺癌组织中表达水平明显下调，并可靶向编码cAMP响应元件结合蛋白1(cAMP Responsive Element Binding Protein，CREB1)基因抑制胃腺癌细胞生长。目前关于血清miRNA-182的表达水平及其对胃癌的诊断效能的研究报道较少。本研究通过检测血清miRNA-182表达水平，分析其与胃癌患者临床病理指标之前的关系，并研究其联合CEA对胃癌的诊断效能及临床意义，为临床早期诊断胃癌提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年6月-2018年6月在我院消化内科就诊经病理学检查证实，且均未进行治疗的胃癌患者68例(胃癌组)，行胃镜病理检查确诊的胃炎患者65例(胃炎组)及健康体检人群65例(对照组)。68例胃癌患者中，男36例、女32例，年龄27～70岁，平均(46.13±12.57)岁；根据胃癌TNM分期第八版，分为Ⅰ～Ⅳ期[7]。其中Ⅰ期9例、Ⅱ期17例、Ⅲ期24例、Ⅳ期18例。胃炎患者未进行治疗，且无肿瘤病史，其中男35例、女30例，年龄28～68岁，平均(46.48±10.58)岁。健康体检人群均无全身性疾病及肿瘤，其中男38例、女27例，年龄27～67岁，平均(46.63±9.64)岁。3组间年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过贵州省人民医院伦理委员会审批(伦理编号：[2017]122)。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2实验主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂原位杂交检测试剂盒、DAB显色试剂盒(均购自武汉博士德公司)、地高辛标记的miRNA-182原位杂交探针(美国Exiqon公司)、TRIzol Reagent、miRNA-182、U6引物(均购自美国Invitrogen公司)、SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)。

1.2.2主要仪器荧光显微镜(日本Nikon公司)、全自动电化学发光免疫分析仪(日本日立公司)、实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)、Allegra X-15R高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)。

1.3方法

1.3.1 原位杂交检测胃癌组织及癌旁组织中miRNA-182表达将石蜡切片常规脱蜡至水，经4%多聚甲醛室温固定，胃蛋白酶消化15 min，预杂交液(20 μL/片)55℃孵育2 h，加入miRNA-182杂交探针液(0.5 μg/μL)55℃孵育过夜；次日，SSC缓冲液梯度充分洗涤切片，室温封闭30 min，生物素化鼠抗地高辛孵育2 h，镜下进行DAB显色；苏木素复染，充分水洗，中性树胶封片，荧光显微镜下观察。

1.3.2血清标本的收集所有研究对象均抽取外周静脉血6 mL，用普通采血管采集，1600 r/min离心(离心半径9.8 cm)10 min，吸取上层液体到干净的EP管；再15 000 r/min离心(离心半径9.8 cm)10 min，吸取上层血清于干净的离心管中，置-80℃冻存。

1.3.3总RNA的提取取200 μL血清加入1 mL TRIZOL进行处理，混匀后冰上静置5 min；加入200 μL氯仿充分震荡后冰上静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心(离心半径9.8 cm)15 min，轻取上层液体加入500 μL异丙醇，冰上静置10 min，12000 r/min离心(离心半径9.8 cm)10 min，弃去上清液留RNA沉淀，加入1 mL 75%乙醇充分混匀，7500 r/min(离心半径9.8 cm)离心5 min，弃去上清液干燥10 min，干燥后加入20 μL DEPC水溶解RNA，并测定RNA的纯度及浓度。

1.3.4实时定量qRT-PCR检测将提取得到的RNA用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。miRNA-182以U6作为内参，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测各组血清miRNA-182的相对表达量。引物设计如下：miRNA-182上游5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，下游5′-CCAGTG- CAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCT- TCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。配25 μL的qPCR反应体系，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。miRNA-182基因的相对表达量按公式(2-ΔΔCt法)计算。

1.3.5组织及血清miRNA-182表达水平结果判定及CEA阳性值界定组织中miRNA-182阳性判断：miRNA-182阳性时镜下显示黄色或棕黄色颗粒样物质；血清中miRNA-182高表达量判断：根据miRNA-182的相对表达量均值为标准，其相对表达量高于均值则为高表达，反之则为低表达；血清中CEA阳性率判断：依据《全国临床检验操作规程》(4版)参考范围(CEA:0～4.7 ng/mL)，CEA>4.7 ng/mL作为判断阳性率的标准[8]。

1.4统计学分析采用SPSS22.0软件进行分析。计数资料以n(%)表示，组间比较采用2检验；miRNA-182相对表达量用均数±标准差表示，CEA呈非正态分布，故用M(P25，P75)表示。各组间miRNA-182表达水平的比较采用单因素方差分析，CEA表达水平的比较采用H检验。采用ROC曲线分析miRNA-182和CEA在胃癌中的诊断价值。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA-182在胃癌组织中的表达情况原位杂交结果显示，miRNA-182在胃癌组织中阳性表达52例，阳性率为76.47%；而miRNA-182在癌旁组织中阳性表达15例，阳性表达率为22.06%，两者相比差异有统计学意义(2=40.273，P<0.05)，见图1。Ⅰ+Ⅱ期胃癌组织中miRNA-182阳性表达12例，阳性率为46.15%；Ⅲ期+Ⅳ期胃癌组织中miRNA-182阳性表达40例，阳性率为95.24%，胃癌分期越晚，患者组织中miRNA-182阳性表达率越高(2=21.503，P<0.05)，见图2。

a：miRNA-182阴性表达；b：miRNA-182阳性表达图1 原位杂交检测miRNA-182在胃癌组织的表达Figure 1 The black frame indicates the site to be mutatedExpression of miRNA-182 in gastric cancer tissues detected by in situ hybridization

a：Ⅰ+Ⅱ期胃癌组织；b：Ⅲ期+Ⅳ期胃癌组织图2 原位杂交检测不同TNM分期胃癌组织中miRNA-182的表达Figure 2 Expression of miRNA-182 in gastric cancer tissues with different TNM stages

2.2miRNA-182和CEA在胃癌组、胃炎组及对照组血清中的表达情况胃癌患者血清miRNA-182相对表达量及CEA的表达水平均高于胃炎患者和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而胃炎患者与对照组相比，miRNA-182相对表达量与CEA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组血清中miRNA-182相对表达量比较Table 1 relative expression of miRNA-182 in serum of each group

2.3不同分期胃癌患者血清中miRNA-182和CEA表达水平Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者血清miRNA-182相对表达量及CEA的表达水平均低于Ⅲ期患者和Ⅳ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)；而Ⅲ期患者与Ⅳ期患者相比，miRNA-182相对表达量与CEA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同分期胃癌患者血清中miRNA-182相对表达量及CEA表达水平的比较Table 2 Comparison of miRNA-182 relative expression and CEA expression in serum of patients with different stages of gastric cancer

2.4miRNA-182的表达水平与胃癌临床指标的关系miRNA-182高表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小等因素无关，而与肿瘤TNM分期、分化程度、转移有关(P<0.05)。分化程度低、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者血清miRNA-182高表达率较分化程度中+高、临床分期为Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移的胃癌患者血清miRNA-182高表达率更高(P<0.05)。见表3。

表3 miRNA-182的表达水平与胃癌患者临床指标的关系[n(%)]Table 3 Relationship between miRNA-182 expression level and clinical indicators in patients with gastric cancer n(%)

2.5血清中miRNA-182及CEA的表达对胃癌的诊断效能miRNA-182诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.850(95%CI 0.786～0.914)，其相应的灵敏性和特异度分别为73.5%和84.6%。CEA诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.947(95% CI 0.913～0.980)，其相应的灵敏性和特异度分别为83.8%和73.4%。两指标联合诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.967(95%CI 0.943～0.991)，其相应的灵敏性和特异度分别为94.1%和86.2%，且两指标联合诊断胃癌的准确性为90.2%，均优于单个指标(78.9%、79.7%)。见图3。

图3 miRNA-182+CEA联合诊断胃癌的ROC曲线Figure 3 ROC curve of miRNA-182 + CEA in the diagnosis of gastric cancer

3 讨 论

胃癌是世界第四大常见肿瘤，也是第二大癌症相关死亡原因。我国胃癌发病率和病死率均居恶性肿瘤首位[9]。目前，胃镜下病理组织活检是胃癌诊断和评估TNM分期的“金标准”；但该方法属于有创检查，患者依从性较差，导致部分患者确诊时多已处于胃癌晚期而失去了最佳的治疗时机[10]。因此，早期诊断并治疗是胃癌患者成功生存的关键。

肿瘤标志物是指机体对新生物发生应激反应进入到体液、组织，或是癌细胞异常分泌或脱落的物质，可提示肿瘤在宿主体内的发生、发展或癌基因、抑癌基因的活化变异程度[11-12]。研究表明，实验室血清肿瘤标志物的检测对消化道系统肿瘤的诊断、预后具有积极意义[13]。CEA是一种酸性糖蛋白，属于胚胎性致癌抗原，其在成人血清中含量极低，是一种广谱肿瘤标志物，在临床上常与其他肿瘤标志物联合检测用于消化道恶性肿瘤的诊断[14-15]。有研究发现，不同分期胆管癌患者胆汁CEA有显著差异，其对胆管癌的诊断具有良好的临床价值，可为胆管癌术前分期提供一定的参考价值[16]。赖晓东等[17]研究报道，CEA检测结直肠癌 ROC曲线面积为0.784，敏感性73.2%、特异性82.5%，其联合脂联素及瘦素可显著提高结直肠癌的检出率。本研究检测结果发现，胃癌患者CEA的表达水平显著高于胃炎患者和对照组，Ⅲ期患者和Ⅳ期患者血清CEA的表达水平高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者；血清CEA诊断胃癌的曲线下面积为0.947(95%CI 0.913～0.980)，其灵敏性和特异度分别为83.8%和73.4%，检测准确性79.7%，提示CEA检测胃癌的灵敏度虽高但特异度不高。有研究也报道单一肿瘤标志物的检测存在特异度或敏感度较低等问题，故临床逐渐采用多种肿瘤标志物联合检测来诊断癌症[18]。

miRNAs在人类疾病中的作用，特别是在肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色，癌症中miRNA通常具有促癌和抑癌作用，miRNA表达模式的改变对癌症的诊断和预测患者的预后或对治疗的反应具有重要作用[19]。miRNA-182可以作为癌基因或抑癌基因发挥作用，这取决于癌症的类型、位置和阶段[20]。Ou等[21]研究报道，miRNA-182通过抑制survivin的表达诱导细胞周期阻滞，从而抑制了舌鳞状细胞癌细胞增殖，起到抑癌基因的作用。而Ling等[22]研究发现，miRNA-182在人胃肠道间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors,GIST)组织中的表达明显高于邻近正常组织，且miR-182的过表达促进GIST-T1细胞的生长，增加细胞增殖，减少细胞凋亡，miR-182的上调也促进了GIST-T1细胞的集落形成和迁移。本研究结果发现，胃癌患者胃癌组织中miRNA-182阳性表达率显著高于癌旁组织，且Ⅲ期+Ⅳ期胃癌组织中miRNA-182阳性表达率显著高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌组织中miRNA-182阳性表达率；胃癌患者血清miRNA-182相对表达量较胃炎患者和对照组均显著上升，上述结果与储怀祝等[5]在胃癌组织中的检测结果一致；且不同胃癌TNM分期的miRNA-182相对表达量差异具有统计学意义。将患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期及转移等可能影响胃癌预后的因素进行单因素分析，结果发现miRNA-182高表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小等因素无关，而与肿瘤TNM分期、分化程度、转移有关。提示miRNA-182在胃癌的进程中起到癌基因的作用，可能促进胃癌的发展。

ROC曲线分析miRNA-182对胃癌的诊断效能，结果显示miRNA-182诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.850(95%CI 0.786～0.914)，其相应的灵敏性和特异度分别为73.5%和84.6%，其检测的准确性为78.9%。进一步分析两指标联合检测对胃癌的诊断效能，结果发现两指标联合诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.967(95% CI 0.943～0.991),其相应的灵敏性和特异度分别为94.1%和86.2%，且两指标联合诊断胃癌的准确性为90.2%，均优于单个指标(78.9%、79.7%)。因此，两者联合检测可为胃癌的诊断提供重要的参考信息。

综上所述，血清miRNA-182联合CEA检测可提高胃癌诊断的灵敏性、特异度和准确性，对胃癌早期发现及治疗具有一定的临床价值。