刺萼龙葵与少花龙葵植物内生菌比较研究

张喜苇 张伊凡 张玉瑶 徐雯 黄婷 张晶

摘要：外来植物入侵对我国农业生产的危害极大，已成为制约农业可持续发展的主要因素之一。利用可培养方法，从入侵植物刺萼龙葵及其近缘非入侵植物少花龙葵体内分别分离出11株和5株内生细菌，其中芽孢杆菌种类居多，两者共有的种类包括贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌3种;不同内生菌在两类植物体内根、茎、叶不同部位分布具有一定的差异性。研究结果为阐明入侵植物刺萼龙葵的入侵机制提供了理论基础。

关键词：内生菌;植物入侵;刺萼龙葵;少花龙葵

中图分类号：S451;R284    文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2021）01-0027-03

外来生物入侵威胁农田环境生态安全、农业生产和人类健康，因此受到各国研究者的广泛关注。刺萼龙葵（Solanum rostratum）又称刺茄、黄花刺茄，是茄科茄属的一种有严重危害的恶性植物，在我国被列为具有较大入侵危险性的检疫植物。少花龙葵（Solallum nigrum）别名白花菜，是茄科一年生草本植物，其为刺萼龙葵的近缘非入侵种。植物内生菌与高等植物在长时间的协同进化中，与植物体内物质或根际分泌物等相互作用，提高宿主植物养分吸收能力、抗逆性、抗氧化性及次生代谢产物生产能力等，通过促进宿主植物的生长来提高其入侵能力。

目前，国内外对刺萼龙葵的研究多集中在传粉机制、生物学特性、萌发特性、除草剂筛选及土壤根际微生物群落的影响等方面，很少探讨入侵植物和其近缘非入侵植物内生菌多样性的差异，以及其对植物入侵能力或过程的影响等。本课题主要通过可培养分离方法，探讨比较入侵植物刺萼龙葵和其近缘非入侵植物少花龙葵植物内生菌种类的差异，以揭示植物内生菌在植物入侵过程中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用刺萼龙葵、少花龙葵种植于常熟理工学院温室大棚内，种植时间为2018年5月27日—8月25日，于2018年8月植株成年时期采集，带回实验室进行内生菌的分离。Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒：杭州博日科技股份有限公司;Taq酶：日本Takara（宝）生物股份有限公司。内生菌分离选用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

1.2 仪器与设备

DHP9162电热恒温培养箱：上海索谱仪器有限公司;PCR扩增仪：美国BIO-RAD公司;化学发光凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司。

1.3 试验方法

1.3.1 内生菌的分离、纯化 将植株切碎块研磨成匀浆菌悬液，依次用生理盐水梯度稀释，得到菌悬液，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，做2个重复，进一步培养观察。根据肉眼观察，对菌落进行分类、标记。多次纯化直至得到单一菌落，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

1.3.2 基因组DNA提取及16S rDNA片段PCR扩增 提取内生菌基因组总DNA，并以其为模板，采用细菌通用引物Eu-bac 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和Eu-bac 1492R （5'-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3'）对细菌基因组的16S rDNA序列进行扩增。

1.3.3 菌株序列测定与比对 将内生菌菌株送至苏州金唯智测序公司进行测序，得到序列结果分别与NCBI中Genbank数据库中亲缘关系相近的菌种利用BLAST软件进行比对，查找相似度最高的序列，确定菌株的分类学地位，并在此基础上利用MEGA7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

将测得的序列与NCBI中Genbank数据库进行比对，找出相似度最高的完整序列，最终归类、确定内生菌的种类。从刺萼龙葵中分离出11株内生菌，其中10株为芽孢杆菌属，分别为贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、耐热芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢桿菌、米虎芽孢杆菌，1株为微小杆菌属（见表1）。从少花龙葵分离出5株内生菌，其中3株内生菌为芽孢杆菌属，分别为贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，2株分别为泛菌属和微杆菌属（见表2）。

由表1和表2可知：入侵植物刺萼龙葵中内生菌的种类多于其近缘非入侵植物少花龙葵。刺萼龙葵与少花龙葵共有的菌有3种，分别为贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌。芽孢杆菌是一类植物根际促生菌，对植物生长具有重要作用。很多研究都从不同种类入侵植物内分离到了芽孢杆菌。石青等人发现，入侵植物黄顶菊聚集对自身有益的功能性细菌（耐寒短杆菌和巨大芽孢杆菌），并通过化感物质直接或间接地促进生长，同时对一些病源微生物（尖孢镰刀菌等）有抑制作用，从而成功入侵。以往研究显示，贝莱斯芽孢杆菌能够产生生防因子，防治植物病害，促进生长;枯草芽孢杆菌具有促生长效果和产吲哚乙酸（IAA）能力;解淀粉芽孢杆菌分泌脂肽类抗菌物质，产生拮抗作用，通过营养与空间的竞争，诱导寄主产生抗性和促进植物生长。这3种菌均具有抗病促生、改良土壤微环境的作用。

在一定程度上，刺萼龙葵体内的内生菌种类比少花龙葵多8种，这些内生菌除了上述作用外，其中的赖氨酸芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌是解磷生物，可增强植物对磷的利用率，提高营养物质、微量元素及矿质元素的吸收率，从而促进种子萌发和幼苗生长;微小杆菌属、耐热芽孢杆菌可作为优势菌株调节菌群，降解土壤污染有机物，减少其对植株的毒害作用。此外，少花龙葵中还分离出泛菌属、微杆菌。研究发现，泛菌属具有固氮作用，在一定程度上增强了少花龙葵作为本土植物的抵抗力。

内生菌在植物的根、茎、叶中分布规律略有不同（见表3）。对于入侵植物刺萼龙葵来说，根内的微生物种类最多，有除微小杆菌外的10种内生菌，茎部有4种内生菌，叶部有3种内生菌;贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在3个部位均有分布。对于非入侵植物少花葵来说，根、茎和叶分别有4种、3种和2种内生菌;贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在3个部位具有分布，而泛菌属仅在茎部分布。与刺萼龙葵不同，解淀粉芽孢杆菌仅在少花龙葵根内分离到。解淀粉芽孢杆菌可以产生赤霉素、吲哚乙酸、细胞分裂素等多种生理活性物质和氨基酸类物质，起到促进植物根系及植株生长、增强植物抗病性的作用，从而间接地减少病害。

兩种植物分离出的所有内生菌的系统发育树如图1所示。

3 结论

入侵植物与微生物之间的相互作用显著影响入侵植物的适应性和竞争力，并在其入侵进程中发挥不同的作用。本课题通过可培养方法，比较入侵植物刺萼龙葵和其近缘非入侵少花龙葵根茎叶不同部位内生细菌。从植物刺萼龙葵分离出11种细菌，其中10种是芽孢杆菌;从少花龙葵中分离出5种细菌，其中3种是芽孢杆菌。今后将进一步通过试验来验证这些细菌在促生、固氮及解磷等方面的生理功能及其对植物入侵的生态效应，从而深入探索植物内生菌如何与植物相互作用及入侵过程的影响机制。

参考文献

[1] 吴志刚，方焱，秦萌，等.刺萼龙葵对中国玉米产业造成的潜在经济损失评估[J].中国农业大学学报，2015，20（6）：138-145.

[2] 魏守辉，张朝贤，刘延，等.外来杂草刺萼龙葵及其风险评估[J].中国农学通报，2007，23（3）：347-351.

[3] 王莉莉，戴志聪，祁珊珊，等.植物内生细菌及其对入侵生态学的启示[J].江苏农业科学，2013（3）：9-12.

[4] 程丹丹，赵菁，田忠赛.入侵植物小蓬草的细菌群落组成和多样性研究[J].安全与环境工程，2019（2）：16-24.

[5] 保朱寿能.紫茎泽兰根内生固氮菌的分离及促生效应研究[D].昆明：云南大学，2017.

[6] 石青.耐寒短杆菌和巨大芽孢杆菌在黄顶菊入侵过程中的作用[D].保定：河北大学，2018.

Comparative Study on Endophytes of Solanum Nigrum and Solallum Nigrum

ZHANG Xiwei， ZHANG Yifan， ZHANG Yuyao， XU Wen， HUANG Ting， ZHANG Jing*

（School of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Suzhou Jiangsu 215500， China）

Abstract： The invasion of exotic plants is harmful to agricultural production in China and has become one of the main factors restricting the sustainable development of agriculture. Using culturable methods， 11 and 5 endophytic bacteria were isolated from the invasive plant Solanum nigrum and its related non-invasive plant Solanum nigrum， among which bacillus were the most common species， and the common species of the two plants were bacillus belis， bacillus subtilis and bacillus amylolyticus; The distribution of different endophytic bacteria in different parts of root， stem and leaf of the two kinds of plants was different. The results provide a theoretical basis for expounding the invasion mechanism of the invasive plant solanum nigrum.

Key words： endophytic bacteria; plant invasion; Solanum rostratum; Solanum nigrum