富硒酵母干预对高脂小鼠GRP78基因表达的影响

吴谷丰　龚顺民　刘丽君　王凯旋　李青连　郝澍

摘 要：目的：探讨富硒酵母干预对高脂大鼠内质网应激基因GRP78表达的影响。方法：选取40只6周龄小鼠作为研究对象，建立高脂小鼠模型，并随机分为4组（a：对照组，b：高脂日粮组，c：高脂日粮+低剂量富硒酵母组，d：高脂日粮+高剂量富硒酵母组），观察肝脏脂肪变性程度，检测肝脏脂质氧化MDA水平和GRP78基因的mRNA表达水平。结果：高脂日粮可以诱发小鼠肝脏指数增大和脂肪变性，饲喂富硒酵母后，小鼠的肥胖和肝脏脂肪变性得到了明显改善;高脂日粮组与其他组相比肝脏中MDA和GRP78基因的表达水平显著升高，高剂量硒酵母对高脂诱发的MDA升高和GRP78基因的表达水平均有拮抗作用。结论：硒能逆转高脂小鼠的肝脏损伤，内质网应激信号通路在其中发挥了作用，该应激可能是通过提高氧化水平而诱导的。

关键词：高脂;富硒酵母;内质网应激;GRP78基因

中图分类号 R332文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）03-0012-04

Effect of Selenium Enriched Yeast Intervention on GRP78 Gene Expression in High-fat Mice

WU Gufeng1 et al.

（1School of Pharmacy and Life Science，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China）

Abstract： Objective：To investigate the effect of selenium enriched yeast intervention on the endoplasmic reticulum stress gene GRP78 expression in high-fat rats. Methods：A total of 40 mice were selected as the research object to establish high-fat mouse model， and randomly divided into 4 groups （a： control group， b： high-fat diet group， c： high-fat diet + low dose of selenium enriched yeast group， d： high-fat diet + high dose group of selenium enriched yeast）. Then， the degrees of liver steatosis were observed， and the liver MDA level and lipid oxidation of GRP78 gene mRNA expression level were detected. Results：High-fat diet could induce the increase of liver index and alleviate steatosis in mice. Compared with other groups， the expression levels of MDA and GRP78 genes in liver were significantly increased， and the high-dose selenium enriched yeast had an inhibitive effect on increase of MDA and the expression levels of GRP78 genes. Conclusion：Selenium can reverse liver injury in high-fat mice， and endoplasmic reticulum stress signaling pathway plays a role in it， which may be induced by increased oxidation levels.

Key words： High-fat; Selenium enriched yeast; Endoplasmic reticulum stress; GRP78 gene

近些年来，随着人们生活水平的提高，心血管疾病的发病率呈逐年上升趋势，并已成为严重威胁着我国居民健康的重大疾病[1]。目前，诱发心血管疾病的病因较多且较复杂，其中高脂饮食引发的血脂异常是导致心血管疾病发生和发展的主要危险因素之一[2，3]。据國家心血管病中心统计显示，截至2018年，我国血脂异常人数已超过4亿人。研究表明，高脂饮食可诱导组织与细胞内产生并累积大量的自由基，从而引起氧化应激，对组织和细胞造成损伤，除此之外还能引起炎性反应和胰岛素抵抗[4，5]。脂肪组织分泌的促炎性细胞因子能够激活下丘脑垂体肾上腺轴，使得系统和代谢之间形成恶性循环。

GRP78（Glucose regulated protein，GRP78）是一种分子质量为78ka的葡萄糖调节蛋白，是细胞内质网功能的核心调节因子，传统认为其主要功能为结合内质网Ca2+、维持细胞内质网的稳定性。近年来，更多的研究发现GRP78在肿瘤的发生中具有重要的作用，与肿瘤细胞的存活、增殖、肿瘤治疗的敏感性密切相关[6]。

硒是一种人与动物所必需的微量矿物质元素，并通过硒代半胱氨酸合成含硒蛋白而发挥其生理功能。目前，国内外研究重点主要放在营养水平或一定范围内高于营养水平的硒尤其是有机硒具有调节机体胆固醇等生化指标的改善，而硒能否调控高脂血症带来内质网应激的研究则较少。江西省作为富硒地区，富硒产品的研发具有十分广阔的前景。富硒酵母是一种高效、安全的硒补充剂。为此，本研究探讨了富硒酵母对高脂饮食诱导小鼠肥胖的逆转作用，并初步通过内质网应激分子的表达揭示其在抗高脂血症中发挥的作用，以期为江西省富硒产品的开发利用提供数据和参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 高脂日粮配方：基础日粮中添加20%蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇和0.2%胆酸钠。富硒酵母（硒含量2000ppm）购于安琪酵母有限公司（生产批号：20141021-02），相应检测试剂盒购于碧云天生物公司。抗凝剂枸橼酸钠购于自索莱宝公司。RNA提取试剂、反转录试剂盒、RT-PCR定量分析相关试剂SYBR Green购于Takara公司。

1.2 试验设计 清洁级小鼠（18.5±0.54g，6周龄，雌雄各半），购于南昌大学实验动物中心。小鼠适应7d后随机分成4组，每组10只。整个试验期间小鼠自由饮水和摄取日粮，每7d称重1次，具体分组如下：a：对照组（饲喂常规日粮）;b：高脂日糧组（饲喂高脂日粮）;c：高脂日粮+低剂量富硒酵母组（按照小鼠体重2μg/kg剂量经口灌胃富硒酵母）;d：高脂日粮+高剂量富硒酵母组（按照小鼠体重8μg/kg剂量经口灌胃富硒酵母）。

1.3 样品处理及测定项目 第7周结束，眼球采血，3000r离心后获得血清。颈椎脱臼处死小鼠，解剖收集肝脏后称重。一部分浸泡于福尔马林溶液中用于做病理切片，另一部分用PBS冲洗干净后保存于?70℃冰箱中。

1.3.1 病理切片（HE染色） 取部分肝组织，经水洗、脱水透明、浸蜡、包埋，得到肝组织石蜡切片，采用显微镜观察不同处理条件下组织细胞形态学的变化。

1.3.2 抗氧化水平测定 MDA检测按照测定试剂盒说明书操作，使用酶标仪测定肝脏中MDA的含量。

1.3.3 相对荧光定量PCR 肝组织中的GRP78的mRNA水平用相对荧光定量PCR进行测定。用RNAiso Plus（TaKaRa）试剂盒，根据说明书从冰冻的组织中提取总RNA。根据Oligo dT primers和RNase M-MLV（TaKaRa，China）说明书取1μg总RNA反转成cDNA。小鼠GRP78的引物序列如表1所示。用Prism Step-One Plus系统（Applied Biosystems，美国）进行PCR反应，反应体系见表1。以GAPDH为内参用2?ΔΔCt法计算mRNA相对水平。

2 结果与分析

2.1 不同处理对小鼠肝脏脂肪的影响 由图1A可知，从第4周起，高脂日粮组的小鼠体重开始显著高于对照组（P<0.05）。图1B是各组小鼠的肝脏指数。经过42d的高脂饲料诱导，与对照组相比，高脂组的肝脏指数极显著升高（P<0.01），灌胃低剂量硒酵母干预后，肝脏指数显著下降（P<0.05），灌胃高剂量富硒酵母后，肝脏指数极显著下降（P<0.01），差异具有统计学意义。由图1C可知，40倍镜下观察，HE染色后的高脂饲料组对比对照组，存在明显的脂肪变性;而加入富硒酵母干预后，脂肪变性得到明显改善。由图1D可知，肉眼所见下，高脂饲料组的小鼠肝脏明显变大变黄，呈现出脂肪肝的特性。

2.2 富硒酵母对高脂饮食小鼠肝脏组织中氧化水平的影响 如图2可知，高脂日粮组与其他组相比肝脏中MDA极显著升高（P<0.01），高剂量硒酵母对高脂诱发的MDA升高有拮抗作用（P<0.05）。

2.3 内质网应激相关基因的表达变化 由图3可知，内质网应激相关基因GRP78的表达，对照组与高脂日粮组、高脂日粮+低剂量富硒酵母组、存在显著差异（P<0.05）;且加富硒酵母干预后，低剂量和高剂量均可以降低GRP78的表达（P<0.05）。

3 讨论

硒是一种人类与动物所必需的微量元素，含硒蛋白在脂蛋白和胆固醇代谢中具有重要的作用[7，8]。Larvie等研究表明，缺硒与肥胖症呈显著正相关，超重/肥胖个体中硒蛋白SEPP1浓度和GPX活性显著低于正常体重个体[9]。流行病学研究表明，高剂量的血清硒浓度可以提升血脂水平的效果。对1042名英国成人进行横断面分析发现，血浆硒水平的升高常伴有TC和LDL的下降[10]。因此，适量地补硒可以相对有效地降低机体的血脂水平。

硒是一种非可再生资源，主要来源于富硒土壤中种植的植物。然而，中国绝大多数地区属于缺硒或者贫硒土壤，且食物中50%～75%的硒含量会在日常的烹饪中损耗，因此，应用现代科学技术对食品中的硒进行生物强化就显得尤为重要[11]。先前硒通常是通过亚硒酸钠添加到食物中，进一步研究证实，有机硒的吸收利用率高于无机硒且毒副作用更低，更适合作为膳食补充剂。酵母菌可快速增长，便于培养，且有积累硒的高容量，因此，酵母菌成为添加有机硒的最普遍使用的且研究最早的载体[12，13]，其主要产物是硒蛋氨酸。

遗传或环境损伤引起内质网功能紊乱导致内质网应激，激活未折叠蛋白反应[14]。内质网应激与众多人类疾病的发生发展密切相关。内质网应激有一个标志性因子：GRP78，该因子可以启动未折叠蛋白反应、调节内质网内Ca2+的稳定、对抗细胞凋亡并促进肿瘤的内药性等[15]。研究表明，内质网应激是导致脂肪组织功能紊乱的重要原因之一[16.17]，因此，探讨调节脂肪组织内质网应激状态的有效措施对于改善脂肪组织功能紊乱具有重要的意义。

饲喂高脂日粮是建立小鼠高脂血症模型的经典方法，主要由于摄入过多脂肪从而导致能量摄取过量，最终引起体内脂质代谢紊乱。本研究结果显示，同时饲喂富硒酵母后，小鼠的肥胖和肝脏脂肪变性得到了明显改善，且与硒浓度的提高成正相关，提示有机硒是一种安全的逆转高脂的添加剂。灌胃硒酵母干预后，肝脏组织中MDA含量下降，证明硒酵母对机体具有良好的抗氧化调节作用。利用荧光定量PCR法来测定组织中内质网应激相关基因GRP78的mRNA相对水平，证明高脂可以诱发内质网应激，该应激可能是通过提高氧化水平而诱导的。

综上所述，硒能逆转高脂小鼠的肝脏损伤，内质网应激信号通路在其中发挥了作用。

参考文献

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（責编：张宏民）

基金项目：江西省科技厅，青年科学基金资助项目，20202BABL216042;江西省教育厅，科技项目，GJJ161081;九江学院，教学改革研究课题，XJJGYB-19-13;江西省卫生厅，江西省卫生计生委中医药科研课题，2017B072。

作者简介：吴谷丰（1999—），男，本科生。 *通讯作者  收稿日期：2020-12-18