母牛舔舐对新生犊牛行为及血清应激和免疫指标的影响

靳 爽 李聪聪 顾宪红

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

对于大多数的哺乳动物来说，分娩后母畜舔舐新生幼畜是一种常见的行为，通过舔舐可以去除幼畜身上的羊水和黏液，使其被毛尽快干燥，有利于提高幼畜对外界环境的适应性及成活率。舔舐过程中的气味识别和触觉接触会使母畜与幼畜之间形成母子联系，使得母畜可以辨别自己的幼仔，达到更好的护理和哺育效果。对于奶牛来说，在没有人为干预的情况下，在分娩后1 h内母牛会花费30%～50%的时间舔舐犊牛[1]。在犊牛生命早期，母牛的存在对犊牛的生长起到积极作用。研究发现，在人工使用奶瓶饲喂犊牛相同数量初乳的情况下，初乳饲喂期与母牛共同饲养的犊牛较母子分开饲养的犊牛日增重多，且生长后期的社会行为表现更为活跃[2]。当犊牛与母牛相处时间增长时，会减少犊牛对陌生环境的恐惧以及利于未来的母性行为表达，犊牛健康、体重增加和未来的生产性能也会提高，同时长期来看，犊牛的存在对母牛的健康和生产性能也有积极影响[3]。在自然条件下，母牛会和犊牛在一起生活6～8个月，在这期间，母牛对犊牛进行哺乳，犊牛可以自然地度过断奶期[4]。而在现代化的奶牛养殖中，生产者为了保证对犊牛进行规范化的人工管理，避免在母子关系建立之后进行母子分离的困难和负面影响，并保证奶牛分娩后能够尽快适应正常的生产流程，一般会在产后对奶牛和犊牛立即进行分离。然而，有观点认为，早期分离对犊牛和母牛来说是一种情感上的应激，会对它们的健康产生负面影响[5]。产后立即分离母牛和犊牛的操作剥夺了犊牛被舔舐的机会，从而使得犊牛在面临母体内环境与外界环境巨大差异的应激条件下不能得到母牛的护理和安抚，这种管理方式降低了母牛和犊牛福利水平[6]。在瑞典、丹麦和挪威的有机乳制品生产中，为了使母牛和犊牛能够进行母子接触，规定了养殖场必须允许犊牛在出生后由母牛进行至少1～3 d的哺乳，以提高犊牛的健康和福利水平[7-8]。我国奶牛场养殖规模较大，这种饲养方式不符合生产实际，但是在产后不立即将犊牛转移走，允许母牛有时间对犊牛进行舔舐，这种操作是可以实现的，但效果如何未见报道。因此，本研究通过行为观察和血清指标测定，探究母牛舔舐对新生犊牛的影响，以期为新生犊牛的管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

本试验于2019年2—4月在山东省曹县银香伟业集团百澳国际牧场进行。

1.2 试验设计及饲养管理

试验选取了30头健康的荷斯坦母犊牛，依据犊牛出生后被母牛舔舐的时长分为2组，对照组(Con组)犊牛出生后仅被舔舐了几下或者没被舔舐，舔舐组(Lick组)犊牛出生后被舔舐15～20 min，每组15头。2组犊牛初生重[Con组(37.75±0.58)kg，Lick组(38.00±0.78)kg]相近。Con组母牛的胎次均为1胎，Lick组母牛的胎次为1～2胎(平均1.4胎)，2组母牛体况适宜(体况评分为3.5～3.75)。犊牛在出生后24 h内由人工使用奶瓶分3次共喂食6 L初乳。犊牛第1次采食的初乳为母乳，第2、3次提供混合初乳，每次饲喂量均为2 L。Lick组犊牛出生后在产圈中被母牛舔舐15～20 min后，而后转移至产圈外等待母牛挤初乳；Con组犊牛出生后5 min内仅被母牛舔舐几下或未被舔舐，而后转移至产圈外等待母牛挤初乳。使用奶瓶将新鲜挤出的初乳饲喂给犊牛2 L，然后为犊牛打耳号，使用5%碘酊对犊牛脐带进行消毒处理，然后将其转移至犊牛舍中进行小群饲养。将4～5头犊牛饲养在3 m×4 m的铺有稻壳垫料的犊牛舍中，犊牛舍内设有暖灯和通风系统，根据天气情况调整暖灯开通数量和通风与否，以保证犊牛舍温度范围在15 ℃左右。

1.3 样品采集与指标检测

1.3.1 行为指标的记录与观察

犊牛舍中安装有摄像机(杭州海康威视数字技术股份有限公司)，将犊牛转移至犊牛舍后，系统立刻开启视频监控，直至24 h后结束摄像记录。Lick组犊牛进入犊牛舍的时间为出生后(32.60±2.36)min，Con组犊牛进入犊牛舍的时间为出生后(28.53±2.97)min。观察的行为指标包括3个方面：1)犊牛第1次站立行为。记录犊牛初次尝试站立的时间(进入犊牛舍至犊牛初次尝试站立的时间间隔)、初次成功站立的时间(进入犊牛舍至犊牛初次成功站立的时间间隔)、初次尝试站立到初次成功站立的时间间隔以及尝试站立的次数。2)犊牛第2、3次采食初乳时的行为。记录犊牛采食初乳时长、采食初乳时站立时长、采食初乳时躺卧时长。3)犊牛在第2、3次采食初乳前、后15 min的行为。记录犊牛站立、躺卧、行走、跑跳、探索、自我梳理行为的时长和次数，记录头部顶撞和摇头行为的次数。犊牛的行为和行为定义见表1。

表1 犊牛的行为和行为定义

1.3.2 血清样品的采集与测定

在犊牛被舔舐之后采食初乳之前(0 h)和被舔舐后24 h时进行颈静脉采血10 mL，将血液室温静置30 min，3 000×g、4 ℃离心15 min后制备完成血清样品，于-20 ℃冰箱中保存待测。血清皮质醇(cortisol，COR)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，其中COR试剂盒由上海江莱生物有限公司提供，IL-2、IL-4、IL-6、IL-1β、TNF-α试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供，严格按照说明书步骤进行操作。

1.4 数据统计与分析

采用SAS 9.4软件对所有数据进行统计分析，犊牛第1次站立行为中的时长以分钟(min)为单位进行描述，采用t检验进行分析；第2、3次采食初乳所用时长以秒(s)为单位进行描述，统计每头犊牛在第2、3次采食初乳时站立时长占总采食时长的比例以及躺卧时长占总采食时长的比例，对数据进行反正弦平方根转换，然后使用MIXED模块对数据进行重复测量的方差分析，以第2、3次采食初乳作为重复测量；采食初乳前、后15 min各行为时长以秒(s)为单位进行描述，为使数据满足正态分布，对各行为时长进行log(x+1)数据转换，对各行为发生次数进行平方根数据转换，然后使用MIXED模块对各行为时长和发生次数进行重复测量的方差分析，以第2、3次采食初乳作为重复测量。犊牛血清指标数据采用t检验进行分析，结果以“平均值±标准误”表示。P<0.05表示差异显著，0.05≤P<0.10表示有差异显著趋势。

2 结 果

2.1 新生犊牛第1次站立行为

由图1-a可知，Lick组犊牛进入犊牛舍后初次尝试站立用时与Con组无显著差异(P>0.10)。由图1-b可知，Lick组犊牛进入犊牛舍后初次成功站立用时有低于Con组的趋势(P=0.056)。由图1-c、图1-d可知，Lick组犊牛进入犊牛舍后在初次尝试站立至成功站立期间的尝试站立次数有低于Con组犊牛的趋势(P=0.094)，且初次尝试站立至成功站立用时显著短于Con组(P<0.05)。

图1 新生犊牛第1次站立行为

2.2 新生犊牛第2、3次采食初乳时的行为

由图2-a可知，对犊牛第2、3次采食初乳过程中采食初乳时长进行分析的结果显示，处理的主效应不显著(P>0.10)，Lick组犊牛采食初乳时长与Con组无显著差异(P>0.10)，采食次数的主效应不显著(P>0.10)，处理效应和采食次数效应的交互作用不显著(P>0.10)。犊牛在采食初乳时要么呈站立状态，要么呈躺卧状态。分别记录了犊牛第2、3次采食初乳时站立和躺卧时长占总采食时长的比例，并加以比较。由图2-b、图2-c可知，Lick组犊牛采食初乳过程中站立时长占总采食时长的比例有高于Con组的趋势(P=0.068)，Lick组犊牛躺卧时长占总采食时长的比例有低于Con组的趋势(P=0.068)，采食次数的主效应不显著(P>0.10)，处理效应和采食次数效应的交互作用不显著(P>0.10)。

图2 新生犊牛第2、3次采食初乳时的行为

2.3 新生犊牛第2、3次采食初乳前、后15 min的行为

由表2和表3可知，Lick组犊牛在第2、3次采食初乳前、后15 min内的站立时长和次数显著高于Con组(P<0.05)，躺卧时长显著低于Con组(P<0.05)，行走时长和次数显著高于Con组(P<0.05)。Lick组犊牛在第2、3次采食初乳前、后15 min内的探索时长有高于Con组的趋势(0.05≤P<0.10)，探索次数显著高于Con组(P<0.05)。2组犊牛在第2、3次采食初乳前、后15 min内的跑跳时长和次数、自我梳理时长和次数没有显著差异(P>0.10)。

表2 母牛舔舐对新生犊牛第2、3次采食初乳前、后15 min行为时长的影响

表3 母牛舔舐对新生犊牛第2、3次采食初乳前、后15 min行为次数的影响

采食初乳后与采食初乳前相比，犊牛的站立时长和次数、行走时长和次数、跑跳时长和次数、探索时长和次数、头部顶撞次数和摇头次数显著增多(P<0.05)，躺卧时长和次数显著降低(P<0.05)，自我梳理时长和次数没有显著差异(P>0.10)。

2.4 母牛舔舐对新生犊牛血清应激和免疫指标的影响

由表4可知，在被舔舐后24 h，Lick组犊牛血清IL-2含量有低于Con组的趋势(P=0.097)，血清IL-6含量显著低于Con组(P<0.05)。在被舔舐后0 h，Lick组犊牛血清COR含量显著低于Con组(P<0.05)。2组犊牛血清IL-4、IL-1β和TNF-α含量在被舔舐后0、24 h时均无显著差异(P>0.10)。

表4 母牛舔舐对新生犊牛血清应激和免疫指标的影响

3 讨 论

3.1 母牛舔舐对新生犊牛初次站立时间的影响

出生后表现出较高的活力对新生幼畜的存活和生长至关重要，并且能使新生幼畜获得较好的福利水平[12-13]。通常将犊牛在没有任何外界帮助情况下站立的能力定义为犊牛的活力[14]。幼畜出生后表现出的第1次站立行为可以反映出其活力高低[15]。吮吸初乳是犊牛摄取营养的唯一途径，初乳的摄入有利于犊牛被动免疫的建立，及时摄入初乳有利于犊牛健康，并提高犊牛存活率[16]。对于新生犊牛来说，在非人工饲喂初乳的条件下，犊牛在出生后需要自主站立，站立之后才可以尽快寻找到母牛乳头以吮吸初乳，站立时间的早晚是影响犊牛吮吸到初乳时间的重要因素。Houwing等[17]研究发现，新生荷斯坦公犊牛第1次成功站立的时间为出生后152.2 min，尝试了17.6次后才成功站立；新生荷斯坦母犊牛第1次成功站立的时间为出生后88.0 min，尝试了15.4次后成功站立。Jensen[18]研究观察到犊牛第1次尝试站立的时间为出生后13～40 min，第1次成功站立的时间为出生后32～90 min(观察对象包括公、母犊牛)。上述研究中均由母牛对犊牛进行哺乳，因此直接观测了犊牛的第1次站立时间，而在当前我国的奶牛养殖生产中，一般不采用母牛哺乳犊牛的饲养方式，而是由人工及时饲喂犊牛初乳，在此期间犊牛会受到人为干扰。因此，本试验在研究犊牛的第1次站立行为时观测的是犊牛被转移至犊牛舍之后无人为干预状态下的行为表现。其中，Lick组犊牛在进入犊牛舍之后32.9 min第1次尝试站立，成功站立所用时间为76.6 min，期间尝试次数为5.1次；Con组犊牛进入犊牛舍之后23.8 min第1次尝试站立，99.7 min时成功站立，期间尝试次数为8.0次。Lidfors[19]研究发现，在出生后被母牛舔舐的犊牛第1次站立时间显著早于未被舔舐的犊牛。本研究中也得到了相同结果，Lick组犊牛第1次站立时间早于Con组，且在成功站立之前尝试站立的次数较少。这表明母牛的舔舐有利于促进犊牛尽快站立，提高了新生犊牛的活力。母牛的舔舐可以使犊牛被毛尽快干燥，减少热量损失，并刺激犊牛呼吸和血液循环，这可能是导致新生犊牛活动水平较高的原因[20]。

3.2 母牛舔舐对新生犊牛采食初乳期间及前、后行为的影响

本研究中发现，相较于Con组，在产后被舔舐15～20 min的犊牛活动动机更强，当采食初乳时，被舔舐的犊牛的站立时长相对较长；且观察到在采食初乳前后被Lick组犊牛站立、行走时长和次数较多，躺卧的时间较少，对外界环境进行探索的时间和次数也较多，这表明被舔舐的犊牛行为较为活跃。行走被认为是由犊牛自主决定的一种放松行为，探究行为则是与积极的情感状态相联系的一种行为，并且可以在积极情绪方面评估动物福利，一般表现出较高的探究行为动机，意味着动物感觉愉悦[21]。吕晶[22]研究发现，与受到消极情感刺激相比，犊牛在受到积极的情感刺激后表现出更多的探究行为。Lick组犊牛表现出的行走行为和探究行为较多，在一定程度上反映出了经由母牛舔舐的犊牛精神状态可能更为积极、放松，更易于接受和适应陌生的环境条件。Li等[23]通过刷拭犊牛来模拟母牛对犊牛的舔舐行为，发现被刷拭组的犊牛较对照组犊牛行为更加活跃，表现出了更多的口部行为，同时与人员的互动也更为积极，在陌生环境中行为也更为活跃。

3.3 母牛舔舐对新生犊牛应激与免疫的影响

COR是由肾上腺皮质分泌的一种主要参与机体糖代谢调节的激素，能够促进动物机体组织中蛋白质和脂肪的分解，是机体发生应激反应时分泌的一种维持生物体正常生理机能的激素[24]。当动物体内COR含量过高时，会导致动物的免疫力降低，出现炎症反应[25]，因此，要尽量避免动物产生较多的COR，尤其是对于新生犊牛来说，犊牛在出生之后，生存环境经历了巨大的转变，由母体子宫转变为外界自然环境，新生犊牛的各项生理机能都不完善，不易适应外界环境，会产生较大的应激反应。在分娩过程中，如果发生难产，胎儿排出期时间过长，就会造成犊牛缺氧，从而促使肾上腺皮质释放更多的COR，加剧犊牛的应激反应[26]。本研究发现，产后被母牛舔舐的犊牛血清COR含量低于未被舔舐的犊牛，这反映出了犊牛出生之后，母牛对其进行舔舐可以降低犊牛对外界环境的应激反应。

细胞因子是免疫细胞或某些非免疫性细胞在受到抗原刺激后合成与分泌的一类小分子蛋白，具有多种生物学功能，如调节免疫应答、参与炎症反应等。根据在炎症反应中所发挥的作用效果，细胞因子可以分为促炎性和抗炎性2类细胞因子。IL-2和IL-4属于抗炎性细胞因子，IL-6、IL-1β和TNF-α属于促炎性细胞因子[27-28]。辅助性T细胞由1型辅助性T细胞(Th1)和2型辅助性T细胞(Th2)组成[29]。IL-2是具有代表性的Th1型细胞因子，对细胞介导的免疫反应至关重要，它会激活和促进T细胞的增殖和分化，以增强细胞免疫[30]。IL-6由Th2型细胞因子分泌的一种多效性促炎症细胞因子，促进B细胞增殖分化，参与体液免疫[31]。有大量的试验和相关研究表明免疫功能和情感、精神状态之间存在相关关系，积极的情感刺激会对动物机体的免疫功能带来正向的影响[32-35]。动物机体受到的情感刺激会诱导血液中一些细胞因子含量的变化，积极的情感刺激会使IL-2含量增加，TNF-α含量降低[36]。吕晶[22]对犊牛进行了食物满足的积极刺激与食物剥夺的消极刺激，发现在积极刺激后犊牛血清中的IL-2含量增加，TNF-α含量减少。母牛对犊牛进行舔舐可以帮助犊牛被毛尽快干燥，促进犊牛的血液循环[37]。本试验也发现了舔舐后犊牛的应激水平会降低，因此，认为母牛的舔舐对新生犊牛来说是一种积极的刺激。Stellar等[33]研究发现，积极的情感刺激和情绪与促炎性细胞因子特别是IL-6含量之间的存在着潜在生物学途径联系。本试验中，在母牛对犊牛进行舔舐之后(0 h)的血清指标测定结果显示，各血清细胞因子含量均无显著差异，推测可能是由于犊牛刚刚出生且母牛仅舔舐了15～20 min就使犊牛离开了母牛，对犊牛的刺激强度较小，也可能是母牛舔舐对犊牛血清细胞因子含量的影响有迟后效应。本研究还发现，在被舔舐后24 h时，Lick组犊牛血清促炎性细胞因子IL-6含量显著低于Con组，同时在行为的观察结果中发现了Lick组犊牛的行为更为活跃，表明母牛的舔舐会对犊牛情感状态产生积极的影响。

4 结 论

母牛对新生犊牛进行15～20 min的舔舐可以降低犊牛的应激水平，增强新生犊牛的活力，同时使得犊牛在随后24 h内的行为更加活跃。因此，建议各牛场在母牛分娩后允许母牛对新生犊牛进行适度的舔舐。