应用分子标记辅助选择培育抗稻瘟病恢复系R153

朱玉君 黄得润 樊叶杨 庄杰云 沈波

（1 中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室/国家水稻改良中心，杭州310006；2 杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州311121；第一作者：zhuyujun@caas.cn；*通讯作者：bshen65@163.com）

水稻是我国最主要的粮食作物之一，培育高产优质多抗的水稻新品种是保证国家粮食安全的重要基础。稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一。全国农技推广网统计，2001 年至2018 年稻瘟病年均发生面积达456.0 万hm2。国家统计局公报，2019 年我国水稻种植面积为2 969.4 万hm2。由此可推测，稻瘟病发病面积会占到种植总面积的15.4%，且稻瘟病一旦发病，减产幅度一般为10.0%～15.0%，发病严重的地块甚至颗粒不收。稻瘟病是水稻持续高产稳产的严重阻碍。

培育抗稻瘟病的水稻品种是减少因病害损失的有效方法。我国对培育抗稻瘟病品种高度重视，在新品种审定过程中，严格实行稻瘟病抗性一票否决制。但从2013 年至2017 年参加国家长江中下游稻区品种区试的800 个籼稻品种的稻瘟病抗性分析结果看，新品种对稻瘟病的抗性不高。试验中，这800 个品种的苗叶瘟、穗瘟和穗瘟损失率在6 个鉴定点的平均病级分别为4.0 级、6.8 级和4.1 级，表现为中感、感和中感；稻瘟病综合指数平均值为4.76，属于中感水平。参试的品种中表现为抗的品种所占比例只有0.2%，没有表现为高抗的品种[1]。由此可见，培育高抗稻瘟病品种任重而道远。

挖掘优异的稻瘟病抗性基因是培育高抗病水稻品种的前提条件。目前，共检测到100 多个稻瘟病抗性基因，其中35 个已被分离和克隆[2]。借助分子标记辅助选择技术，部分抗性基因已应用于重要杂交稻亲本的改良，如JIANG 等[3]应用9 个稻瘟病抗性基因（Pi37、Pit、Pid3、Pigm、Pi36、Pi5、Pi54、Pikm 和Pib）改良两系不育系Y58S、广占63S、C815S 和HD9802S，获得51 份携带1 个或2 个抗性基因的品系；CHEN 等[4]应用Pi9，Pi47，Pi48 和Pi49 改良两系不育系C815S，获得多份聚合1～3 个抗稻瘟病基因的品系。另外，还有三系恢复系福恢673 的改良[5]，不育系华1228S[6]、恢复系R163 和R167[7]的选育均基于抗性基因的挖掘。

本研究将来源于谷梅2 号的稻瘟病抗性基因Pi25（具有抗性强、抗谱广的特点）作为目的基因[8]，以携带该抗性基因的品系BL108 为供体亲本，与自选恢复系恢11-32 配制组合，利用与Pi25 紧密连锁的分子标记及功能标记进行基因型检测，以期培育出抗稻瘟病的优良恢复系，为杂交稻品种选育提供抗病亲本资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究所用水稻材料为恢复系恢11-32 和携带稻瘟病抗性等位基因Pi25 的品系BL108。恢11-32 是以中恢161 为母本、蜀恢85 为父本杂交后，通过系谱法选育而成的恢复系，具有良好的株叶形态，恢复力强，但感稻瘟病。BL108 来源于组合G36/中恢9308，其中G36 是从中156 和谷梅2 号重组自交系群体中筛选出的1 份携带Pi25 纯合抗性等位基因的抗稻瘟病株系。G36 与中恢9308 杂交后，自交加代，经分子标记辅助选择和性状鉴定，筛选出1 份高抗稻瘟病的品系，命名为BL108[9]。

2011 年冬季在海南陵水，以恢11-32 为母本、BL108 为父本配制杂交组合。2012 年夏季在浙江杭州，种植6 株F1，成熟后挑选1 株收种。2012 年冬季在陵水种植F2群体，约500 个单株，挑选到360 个具有优良株叶形态的单株收种。2013 年夏季在杭州种植360个株系，挑选到表型优良的97 个F3单株，成熟后收获各单株种子用于基因型鉴定。

表1 R153 的稻瘟病抗性鉴定结果

图1 Pi25 连锁标记Si13070C 对F3 单株的检测结果

图2 Pi25 功能标记CAP3/BglⅡ对候选恢复系的检测结果

1.2 DNA 提取

取约20 粒种子置于培养皿，在光照培养箱生长1周后，在各培养皿中混取8 株幼苗叶片，参照ZHENG等[10]方法进行DNA 提取。

1.3 标记检测

本研究所用的分子标记共2 对，与Pi25 紧密连锁的STS 标记Si13070C[9]和功能标记CAP3/BglⅡ[11]。前者主要用于低世代大群体基因型检测，后者用于高世代苗头恢复系检测。Si13070C 上游引物序列为ATAACGTGTGTCCATAACAGT， 下 游 引 物 序 列 为TTAATGACTCGTGTATAGAGC；CAP3/Bgl Ⅱ上 游 引 物序列为CCTCACGTTTCTACGTCTTG，下游引物序列为CACACCATTTCTGATGAACC，限制性内切酶为BglⅡ。PCR 扩增体系、反应条件和凝胶电泳检测参考前人研究结果[9，11]。

1.4 稻瘟病抗性鉴定

稻瘟病抗性鉴定在福建省上杭县茶地国家水稻新品种稻瘟病抗性区试点进行。鉴定材料种植20 株，株行距16.7 cm×16.7 cm，四周种植感病诱发品种广陆矮4 号，叶瘟、穗颈瘟调查参照陈锦文等[12]的方法。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病抗性基因Pi25 的检测

应用与Pi25 紧密连锁的STS 标记Si13070C 对97份材料进行基因型检测，部分样品检测结果如图1 所示，最终有26 份样品呈纯合型Pi25 抗性等位基因。将这26 份DNA 对应的单株于2014 年夏季在杭州种植F4株系，通过进一步表型观察，挑选6 个株系作为候选恢复系。2014 年冬季在海南陵水，6 个F5株系分别与不育系306A 进行配组。同时，提取DNA，应用Pi25 功能标记进行基因型检测验证。结果表明，6 个株系均携带Pi25 抗性等位基因（图2）。2015 年夏季在杭州种植6 个测交组合，其中1 个组合表现突出，将对应恢复系命名为R153。

2.2 稻瘟病抗性鉴定结果

从表1 可见，感病对照广陆矮4 号苗瘟发病率8%，鉴定为5 级；R153 苗瘟发病率0%，鉴定为0 级。广陆矮4 号叶瘟发病率18%，鉴定为9 级；R153 发病率7%，鉴定为4 级。广陆矮4 号穗瘟发病率100%，鉴定为9 级；R153 发病率5%，鉴定为1 级。抗性综合评价R153 为抗稻瘟病。

3 讨论

本研究通过分子标记辅助选择将Pi25 抗性等位基因导入恢复系恢11-32 中，选育出新恢复系R153，经稻瘟病抗性鉴定表现为抗病。在与多个不育系测配中，发现该恢复系与潢达A 配组获得的杂交稻组合表现出较强产量杂种优势。在2019 年中国水稻研究所组织的所内晚籼新品种比较试验中，比对照五优308 增产11.3%，比天优华占增产4.7%。R153 的选育为杂交稻新组合选育提供了新的亲本资源。

分子标记辅助选择已成为新品种选育的常规手段，其主要优势在于分子标记检测与表型鉴定的吻合度高、检测时间不受水稻种植季节限制。本研究用于检测Pi25 的分子标记Si13070C 为紧密连锁标记，CAP3/BglⅡ为功能标记，后者在基因型鉴定过程中需要进行酶切反应，增加了检测成本和时间。在本研究中，我们先用连锁标记进行初步检测，结合基因型和表型淘汰大量个体，再对中选的少数苗头材料用功能标记进行验证，可有效减少工作量和试剂成本。

对于本研究的目的基因Pi25，研究表明该抗性基因在我国稻种资源中频率较低[13]，但其对稻瘟病表现出良好抗性。本课题组近10 多年来一直围绕该基因进行分子标记辅助选择育种。早在2010 年，借助分子标记辅助选择选育出携带Pi25 抗性等位基因的20 份候选恢复系和27 份候选保持系[9]，并将这些抗性材料提供给多家育种单位，目前已成功改良和选育出多个杂交稻亲本：如以BL108 为供体亲本，改良两系不育系浙科22S，获得5 个综合性状表现良好且抗稻瘟病的两系不育系品系[14]；以BL47 为供体亲本，改良三系保持系福稻B，获得5 个候选保持系[15]；以BL27 为供体亲本，改良臻达B，获得新不育系157A[16]；以BL5 为供体亲本，改良RGD-7S，获得具有较好应用前景的两系不育系元亨S，由该不育系配组获得的杂交稻组合元两优676（审定编号：闽审稻20190012）和元两优6503（审定编号：闽审稻20200020）已通过福建省品种审定。这些品种的改良和选育均表明Pi25 具有良好的育种应用价值。

致谢：本研究所用不育系306A 和潢达A 由福建省农业科学院水稻研究所黄庭旭研究员提供，谨致谢意！