针刺对戊四氮致痫大鼠抗癫痫机制的研究*

何 青，张齐娟，甘学文，曹庭欣

(湖北六七二中西医结合骨科医院，湖北 武汉 430000)

癫痫(Epilepsy)是神经系统常见疾病之一，是多种原因引起的反复发作的脑功能失调综合征，以短暂脑神经元异常放电引起痫样发作为特征，临床表现为突发性意识丧失及肢体抽搐。癫痫的发病率与年龄有关，儿童和青少年发病率较高，随着我国人口老龄化，脑血管病、痴呆等神经系统疾病发病率升高，癫痫在老年人群的发病率呈上升趋势。据世界卫生组织(WHO)统计，全球大约有5 000万癫痫患者，国内流行病学资料显示我国目前有癫痫患者约900万，活动性癫痫600余万，且每年以45万新患者数增长，患病率达5‰～7‰。癫痫属中医学“痫病”范畴，针刺疗法是中医学特有的治疗疾病手段，数千年大量临床实例证实针刺可抑制癫痫发作，但其作用机制至今尚未完全明了。为探究针刺治疗癫痫的作用原理，本研究以戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)致痫的SD大鼠为研究对象，针刺百会、大椎穴观察对其行为学的影响，检测癫痫大鼠脑内细胞凋亡因子caspase-3、bax和bcl-2的表达变化，为临床针刺治疗癫痫提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

健康雄性SD大鼠252只，体质量180～220 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。戊四氮(Sigma公司)；兔抗caspase-3抗体(Santa Cruz公司);RT-PCR试剂( Fermentas公司);bcl-2、bax引物(上海生工生物技术有限公司合成);兔抗bcl-2抗体、兔抗bax抗体(博士德公司)。

1.2 分组造模和行为学表现观察

将实验动物随机分成3组:生理盐水对照组(NS组)、戊四氮致痫组(PTZ组) 、戊四氮致痫组+针刺治疗组(针刺组)。癫痫发作分级参考Racine[1]的标准, 由轻到重分为6级。0级：无行为学改变；Ⅰ级：动物出现须动，咀嚼；Ⅱ级：动物出现头面部抽搐；Ⅲ级：动物前肢或后肢节律性抽搐或阵挛；Ⅳ级：四肢节律性抽搐；Ⅴ级：全身强直性抽搐，并伴有甩尾或翻滚。针刺组于腹腔注射PTZ前半小时予针刺预处理，将该组大鼠固定于脑立体定位仪，参考《实验针灸学》[2]《大鼠脑立体定位图谱》[3]选取大鼠百会穴(GV20，顶骨正中)、大椎穴(GV14，定位：第7颈椎与第1胸椎之间，背部正中)，局部碘伏擦拭消毒，持0.25 mm×40 mm针灸针斜刺入百会穴、垂直刺入大椎穴,进针约15 mm深，每隔5 min行针1次。留针30 min后，PTZ组和针刺组大鼠分别予60 mg/kg PTZ 腹腔注射诱导建立癫痫模型，NS组腹腔注射等量生理盐水，观察各组大鼠行为学表现。针刺组大鼠腹腔注射0.5 h后再次行针刺治疗30 min。

1.3 免疫组化法检测大脑皮质、海马Caspase-3的免疫反应性

各组大鼠分别于造模后36 h、72 h时间点予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速开胸，经左心室插管至升主动脉，快速灌注约37 ℃生理盐水200 mL置换出血液，再以4%多聚甲醛(pH7.4)缓慢灌流30 min后，断头取脑组织块，于4%多聚甲醛中后固定18～24 h，20%蔗糖中浸泡脱水过夜，冰冻成块后于冰冻切片机上切片,每片厚25 μm，选取含背侧海马及大脑皮质的切片贴于明胶载玻片上，按照常规SABC染色操作步骤，滴加一抗兔抗caspase-3(1∶100)于4 ℃冰箱中孵育48 h，滴加二抗生物素化羊抗兔IgG(1∶100)孵育1 h，滴加SABC三抗(1∶100)孵育1 h，滴加DAB显色5～10 min。各步骤之间用PBS充分漂洗，脱水、透明和中性树胶封片，于Olympus BX 51显微镜下观察、摄片。免疫染色对照试验用PBS代替一抗，其余步骤同前。

1.4 半定量RT-PCR检测海马bcl-2、bax mRNA含量

按设定时间点对各组大鼠断头取出海马组织，加入Trizol提取总RNA，将其溶解在DEPC水里，按照逆转录试剂盒进行逆转录得cDNA， bcl-2、bax引物序列根据bcl-2 cDNA序( GenBank AF218388)，利用Primer5软件设计，Bcl-2上游引物：5′-TATGATAACCGGGAGATCGTGATC-3′，下游引物：5′-GTGCAGATGCCGGTTCAGGTACTC-3′,Bcl-2的扩增参数为：94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33个循环，扩增产物的长度为525 bp；Bax上游引物：5′-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT-3′，下游引物：5′-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3′，Bax的扩增参数为：94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，扩增产物的长度为298 bp；内参β-actin上游引物：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，产物扩增长度为316 bp，β-actin的扩增参数为：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环,扩增产物的长度为316 bp，最后72 ℃延伸10 min后，再放4 ℃。将PCR产物置于0.2%琼脂糖凝胶于50～60 V电泳槽里电泳2 h后于透视紫外灯下观察、摄片，经凝胶扫描仪处理分析条带吸光度值(OD值)。每个样本表达水平以其与β-actin吸光度的比值来表示。

1.5 显微图像分析和统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠行为学表现

根据Racine癫痫发作分级标准,本实验中，PTZ组有须动、四肢节律性抽搐及全身强直阵挛发作，5 min左右达高峰，持续约10 min，以后逐渐减轻，发作为Ⅲ～Ⅴ级；针刺组抽搐发作的程度、持续时间及频率明显减低，I～Ⅲ级；NS组未见明显行为异常。

2.2 各组caspase-3免疫组化结果

从神经元的caspase-3免疫组化染色照片可见，在36 h及72 h时间点，NS组大脑皮质及海马均有caspase-3免疫染色阳性细胞,见图1中A、D、G、J;36 h时间点PTZ组大鼠大脑皮质及海马锥体细胞层免疫染色较NS组显著增强,见图1中B、H;免疫染色阳性细胞数明显增多;针刺组免疫染色及阳性细胞数较PTZ组降低,见图1中C、I，但强于NS组(P<0.05);72 h时间点趋势更为明显，见图1中E、K、F、L。各组平均吸光度(A)值的差异具有统计学意义，见表1。

注:A、G为36 h NS组，B、H为36 h PTZ组，C、I为36 h 针刺组，D、J为72 h NS组，E、K为72 h PTZ组，F、L为72 h针刺组。图1 caspase-3免疫组化染色图

分组n大脑皮质(36 h)海马(36 h)大脑皮质(72 h)海马(72 h)NS组420.378 8±0.019 30.196 0±0.013 60.390 1±0.025 50.175 6±0.019 3PTZ组420.620 9±0.028 1﹡0.381 0±0.091 5﹡0.841 2±0.031 7﹡0.538 5±0.024 2﹡ 针刺组420.485 0±0.037 4#0.277 1±0.019 6#0.579 0±0.031 7#0.367 4±0.021 6#

2.3 各组RT-PCR检测bcl-2、bax表达结果

在36 h和72 h时间点，PTZ组bcl-2 mRNA的表达较NS组明显减少(P<0.05)，针刺组bcl-2 mRNA的表达较NS组明显减少、较PTZ组增加(P<0.05)，72 h点趋势更为明显。bax蛋白与bcl-2的表达水平呈负相关。RT-PCR电泳条带扫描图像及分析结果见表2、图2。

图2 各组海马bcl-2、bax蛋白表达水平

3 讨论

癫痫的发病机制十分复杂,目前尚未完全阐明，研究表明，其发生发展与炎性因子释放、神经细胞凋亡、突触重构和胶质细胞功能异常等因素密切相关[4]，几大因素之间可能存在着相互促进、互为因果的关系，干预这些病理过程，或许能够在一定程度阻断癫痫的发生、发展。戊四氮(PTZ)是一种经典的致痫剂，戊四氮致痫模型被认为是一种较理想的急性全身强直-阵挛发作模型，其作用机制为PTZ竞争性地识别抑制性神经递质GABA位点, 从而阻遏由GABA介导的兴奋抑制作用，引起癫痫发作[5]。癫痫引起大脑皮质和海马结构神经元凋亡，癫痫动物模型研究发现，癫痫所诱导的神经元死亡在细胞化学和形态学上有细胞凋亡的特征[6]。

大量研究显示，bcl-2家族和caspase家族在细胞凋亡转导通路尤其是线粒体途径中发挥了极为重要的调控作用,是近年来凋亡研究的热点。caspase是一类存在于胞质中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶,caspase-3蛋白酶位于凋亡级联反应下游，被称为“死亡执行蛋白酶”，执行剪切细胞结构蛋白的作用，直接使细胞发生凋亡[7]。bcl-2家族中bcl-2和bax基因是目前已知的在凋亡调控过程中功能相互对立的一对最重要的调控基因,通常情况下bcl-2和bax两种蛋白的表达量相对稳定，当bax在细胞内超表达时，bax/bax同源二聚体的数量明显增多，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡；而当bcl-2高表达时，则bax/bax二聚体大量解离，生成更为稳定的bcl-2/bax异源二聚体，对抗其诱导凋亡的作用，使细胞存活期延长[8]。研究发现[9]bcl-2、bax不但可作为caspase-3的上游调控机制，参与对caspase-3活性的调节，还可作为caspase-3的直接底物作用于caspase-3的下游，二者在细胞凋亡传导过程中既相互联系又相互制约。大量实验证明，在caspase-3激活之前进行干预，可以有效抑制凋亡发生。

“百会”穴位于两侧三叉神经第一支额神经与枕大神经的重叠支配区域，针刺“大椎”穴可刺激第8颈神经和脊髓，有研究[10-11]表明电针刺激癫痫大鼠百会、大椎穴，脑电图痫波出现明显的潜伏期延长、波幅降低及痫波密度减小，拟认为电针刺激癫痫大鼠百会、大椎穴产生的神经冲动传入脑干三叉神经感觉核后，经网状结构投射到脑内多个区域，产生抑痫信号抑制受损神经元的异常放电。

本研究以凋亡相关因子caspase-3、bcl-2和bax作为观察指标，以PTZ致痫大鼠并予以针刺百会、大椎穴,观察各组大鼠的行为学表现，并分别于造模后36 h和72 h时间点取材，采用免疫组织化学法检察各组大鼠大脑皮质及海马神经元caspase-3的免疫反应性，采用半定量RT-PCR法检测大鼠海马bcl-2、bax 蛋白的表达情况，探讨针刺对癫痫发作后神经元凋亡的影响。观察发现，大鼠腹腔注射PTZ数分钟后PTZ组大鼠即出现明显抽搐，针刺组大鼠抽搐发作的程度、持续时间及频率明显减低；在36 h时间点，PTZ组大脑皮质及海马神经元caspase-3的免疫反应明显强于对照组，bcl-2 mRNA表达较对照组减弱而bax表达明显增强，针刺组caspase-3的免疫反应弱于PTZ组,bcl-2表达较PTZ组增强，bax则相对减弱，72 h时间点各组更为显著, bcl-2与bax蛋白的表达水平均呈负相关。实验结果表明针刺PTZ致痫大鼠百会、大椎穴可减轻癫痫发作程度，抑制癫痫大鼠大脑皮质及海马神经元caspase-3的免疫反应性，拮抗bcl-2、bax蛋白的表达失衡。

本研究进一步证实PTZ致痫诱导大鼠海马神经元凋亡，针刺可一定程度拮抗凋亡发生、减轻癫痫发作程度，其作用机制可能是通过干预凋亡相关因子的表达、调控神经细胞凋亡途径从而发挥神经保护作用，为临床针刺治疗癫痫提供了新的科学依据。