灰色关联分析法评价不同产地牡丹皮药材质量

王 斌 梁伟龙 林钦贤 康志英* 王其丰 郭长达

1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.宁夏回族自治区隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 隆德 756300 3.安徽省亳州市沪谯药业有限公司，安徽 亳州 236800；

牡丹皮为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，味苦、辛，微寒，归心、肝、肾经，具有清热凉血、活血化瘀的功效[1]，主产于安徽、山东、河南、湖南、湖北、四川、重庆等地。牡丹皮中主含酚及其苷类、单萜及其苷类两大类，亦含有机酸、三萜、黄酮、香豆素、挥发油、多糖及微量元素等多种成分[2-7]。

灰色关联分析法为灰色系统理论的重要组成部分，主要针对信息不完全、机制不明确的灰色系统，根据数据序列曲线的相似程度分析因子间的量化和序化，实现对系统的预测、决策等功能[8-11]，目前已在许多中药研究中应用，如基于灰色关联分析方法评价甘肃产红芪质量[12]、牡丹皮不同采收期质量综合评价研究[13]，采用灰色关联度法综合评价不同采收期的牡丹皮药材质量，取得了许多科技成果。为了客观、全面地评价不同产地牡丹皮药材的质量，本实验以17个不同产地牡丹皮药材为研究对象，按《中华人民共和国药典》2015版方法测定浸出物和总灰分，采用HPLC法同时测定其没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍药苷含量，结合灰色关联分析法，建立灰色关联度模型，为牡丹皮药材质量评价提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)、MX5型、XS-204型电子天平(Mettler Toledo)、DHG-9245A电热鼓风干燥箱、HWS-26型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、SXL-1208型程控式箱式电炉(上海精宏实验设备有限公司)

1.2 材料 没食子酸(110831-201605，纯度90.8%)、儿茶素(110877-201604，纯度99.2%)、芍药苷(110736-201539，纯度96.4%)、丹皮酚(110708-201407，纯度99.9%)和苯甲酸(100419-200301)购自中国食品药品检定研究院；氧化芍药苷(MUST-16021505，纯度99.93%)和苯甲酰芍药苷(MUST-16061803，纯度99.28%)购自成都曼斯特有限公司；HPLC级甲醇(Merck)和磷酸(阿拉丁)；其余试剂为分析纯，超纯水。牡丹皮药材于2017年先后于安徽、山东、湖南、湖北、重庆、四川等牡丹皮药材主产区收集，经广州市香雪制药股份有限公司康志英高级工程师鉴定为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，样品来源信息见表1。

表1 不同产地牡丹皮药材来源信息

2 方法与结果

2.1 浸出物 按《中华人民共和国药典》2015年版四部醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂。

2.2 总灰分 按《中华人民共和国药典》2015年版四部总灰分测定法(通则2302)进行测定。

2.3 多成分含量测定[14]

2.3.1 对照品溶液制备 取对照品没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍药苷适量，精密称定，加50%甲醇水分别制成每1 mL含没食子酸0.5 μg、0.5 μg、15 μg、20 μg、20 μg、50 μg、50 μg的混合对照品溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液制备 取牡丹皮药材粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密移取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm的滤膜，即得。

2.3.3 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；检测器为DAD检测器；检测波长为230 nm，258 nm(氧化芍药苷)；流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，10%A→32%A；15～25 min，32%A→48%A；25～40 min，48%A→58%A)；流速为1 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。在此条件下，取对照品溶液、供试品溶液分别进样10 μL分析，HPLC色谱图如图1所示。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.1”项下的混合对照品溶液1、3、5、7、10、15 μL，在“2.3.3”项色谱条件下分析，以对照品的量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，结果见表2。

2.3.5 精密度试验 精密吸取“2.3.1”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，记录7个对照品峰面积，结果显示7个成分的峰面积RSD均小于1.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.3”项色谱条件下分别于0、3、6、9、12、18、24 h进样分析，记录7个成分的峰面积，结果显示7个成分峰面积RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.7 重复性试验 精密称定同一样品粉末6份，按“2.3.2”方法平行制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积，计算含量。结果显示7个成分的含量RSD均小于2.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的牡丹皮粉末约0.25 g，共6份，加入与7个成分等量的对照品，按照“2.3.2”项下方法平行制备供试品溶液，计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果 (%)

2.4 各指标成分含量测定 取不同产地牡丹皮药材样品，分别按“2.1”、“2.2”、“2.3”项下方法测定浸出物、总灰分、以及没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍药苷的含量，结果见表4。

表4 牡丹皮样品9种指标成分的含量测定结果 (%，n=3)

2.5 灰色关联度分析法的建立

2.5.1 参考序列选择 设有n个研究样品，每个样品有m项评价指标，组成评价单元序列，记为{Xik}(i=1，2，3……n；k=1，2，3……m；本研究中n=17，m=9)。为了统一药材质量评价标准，采用将低指标高优化的方法，本试验将总灰分进行取倒数转换，与没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍药苷和浸出物指标共同组成指标矩阵。药材质量评价指标统一后，将最优参考序列的各指标对应n个不同产地样品对应指标的最大值，记为{Xsk}=max(1≤i≤n){Xik}，最差参考序列的各指标对应n个不同产地样品对应指标的最小值，记为{Xtk}=min(1≤i≤n){Xik}。

2.5.2 原始数据规格化处理 以平均值变换最为常用，见公式(1)。

(1)

式(1)中Yik为数据经规格化处理后的数值，Xik为原始测定数值，Xk为第n个药材样品的第k个指标的平均值。

2.5.3 关联系数的计算 分别按公式(2)和公式(3)计算相对于最优、最差参考序列的关联系数。

(2)

式(2)中Δmin= min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|(i=1,2……n;k=1,2……m)

(3)

2.5.4 关联度的计算 相对于最优参考序列、最差参考序列的关联度分别按公式(4)、(5)计算得到。

(4)

(5)

2.5.5 相对关联度的计算 最佳评价单元是评价单元与最优参考序列关联程度最大，同时与最差参考序列的关联程度最小值，所以将评价单元序列同时相对于最优参考序列和最差参考序列的相对ri关联度定义为公式(6)。

(6)

2.5.6 样品数据集的建立 测定不同产地牡丹皮药材中9种成分的含量，建立牡丹皮药材质量灰色模式识别数据集，见表4。

2.5.7 数据规格化处理 将原始测定数值按公式(1)进行数据规格化处理，结果见表5。

表5 不同产地牡丹皮药材的原始数据规格化处理

表6 评价单元序列相对于最优参考序列的关联系数

表7 评价单元序列相对于最差参考序列的关联系数

2.5.9 关联度与相对关联度的计算 分别按公式(4)、(5)计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的关联度ri(s)、ri(t)，按公式(6)计算出17个不同产地牡丹皮药材样品的相对关联度ri，并进行质量排序，结果见表8。

表8 牡丹皮药材关联度、相对关联度及质量排序

2.5.10 药材质量评价 相对关联度ri越大，表明该产地牡丹皮药材的质量评价越高，ri排序结果可作为药材质量高低评价的依据。由表8可见，17个产地牡丹皮药材样品的相对关联度在0.314～0.597之间，其中6个产地样品的相对关联度>0.50，5个产地样品的相对关联度在0.45～0.50之间，6个产地样品的相对关联度<0.45，表明不同产地牡丹皮药材质量存在差异。山西运城绛县(S07)、山西运城闻喜(S06)、安徽铜陵(S01)、安徽南陵(S09)和陕西商洛(S15)的相对关联度分别为0.597、0.583、0.546、0.537、0.532，排名前5位，药材质量评价优。湖北恩施利川(S10)、重庆垫江(S17)、亳州十九里(S03)、亳州五马(S04)、亳州华佗(S02)和山东菏泽(S05)的相对关联度分别为0.414、0.401、0.392、0.381、0.376、0.314，排名后6位，药材质量评价较差。

3 讨论

3.1 流动相系统的选择 在建立牡丹皮药材多成分含量测定的过程中，曾对流动相洗脱系统进行优选，选择甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液等多种流动相洗脱系统进行比较，结果显示，甲醇-0.1%磷酸水溶液流动相系统基线平稳，干扰较小，各指标成分峰分离度良好，故选择甲醇-0.1%磷酸水溶液为牡丹皮的流动相系统。

3.2 提取方式的选择 本试验考察超声提取、回流提取的提取方式，结果显示，回流提取的芍药苷和丹皮酚峰面积均高于超声提取，且重复性结果优于超声提取。比较回流提取0.5 h、1 h、1.5 h，回流1 h和1.5 h含量相近，而芍药苷峰面积略高于0.5 h，综合考虑，确定牡丹皮供试液的提取方式为回流提取1 h。

3.3 粉末粒径的选择 本试验考察2号筛、3号筛、4号筛不同筛目的粉末粒径，结果显示，2号筛样品丹皮酚的重复性较3号筛、4号筛的差。3号筛与4号筛样品的重复性总体情况良好，两者含量相近，其芍药苷峰信号均高2号筛粉末样品，综合考虑，确定选择牡丹皮粉末粒径为3号筛。

3.4 定容溶剂的选择 本试验在稀释定容过程中考察0%～100%的甲醇溶液，结果显示，0%～40%的甲醇溶液稀释的色谱图中色谱峰数量较少，而60%～100%的甲醇溶液稀释的部分色谱峰的峰型较差，分离度低，部分色谱峰出现裂峰，而50%的甲醇溶液稀释较为良好，色谱峰数量较多，信息量较大。综合考虑，确定选用50%的甲醇溶液进行稀释定容。

3.5 检测波长的选择 本试验考察230 nm、258 nm、265 nm、274 nm、292 nm等检测波长，结果显示，检测波长为258～292 nm，色谱峰数量减少，包括芍药苷在内的一些特征信息未表达出来；检测波长为335 nm时，基本上只有丹皮酚一个色谱峰，而检测波长为230 nm时，色谱图的峰数目、信息量较大，综合考虑，确定选择230 nm为牡丹皮的检测波长。

4 结论

本实验结果表明，不同产地牡丹皮药材质量存在差异。山西运城产地牡丹皮药材中儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷和浸出物含量明显高于其他产地，说明其药材质量评价较高；安徽铜陵、南陵所产的牡丹皮药材质量排序第3、第4名，说明其药材品质较优，这也与安徽铜陵和南陵为牡丹皮的道地产区相吻合；湖北恩施、重庆垫江、亳州、山东菏泽产地牡丹皮样品的相对关联度排名靠后，说明其药材质量较差。

牡丹皮化学成分众多，成分的多样性致使其质量很难控制，单一的指标成分不能准确反映牡丹皮的药效和质量，使其在分析评价药材的质量时损失信息量太多。本研究以相对关联度为测度，结合灰色关联分析法，建立一种牡丹皮药材质量综合评价的模型，客观整体地反映牡丹皮药材的内在质量，为牡丹皮药材的综合质量评价提供了新思路，也为牡丹皮资源的开发利用提供参考依据。