微波消融治疗肿瘤的免疫效应研究进展

周洁龙 程实 张余

微波消融(microwave ablation)可通过电磁波使生物体内的极性分子(主要是水分子)反复快速摩擦产生高温，从而实现肿瘤的灭活，目前广泛应用于肿瘤的临床治疗[1]。作为一种局部热疗技术，微波消融在2013年被写入肝癌治疗临床实践指南，同时也应用于肺癌和结直肠癌等的治疗[2-4]。微波消融具有升温速度快、瘤内温度高、凝固性坏死彻底和激发机体抗肿瘤免疫效应等特点，与其他热疗技术相比，微波不受焦痂及干燥影响，对周边血流影响较小，在灭活肿瘤组织的同时对周围组织损伤较轻，因此特别适用于骨和肺等高阻抗(电阻大)脏器肿瘤的治疗[5-6]。

微波消融不仅可通过热效应直接杀伤肿瘤，还可通过消融过程中肿瘤抗原和危险信号分子的释放诱导机体产生抗肿瘤免疫效应，使患者在肿瘤治疗中获益[7-10]。但是，目前对微波消融激发免疫反应机制尚缺乏深入的研究。对微波治疗肿瘤的免疫效应的探究有利于微波消融在临床中的应用及推广。在此对已有的微波消融治疗肿瘤的免疫原性死亡机制及相关病理改变过程的文献报道进行综述，并展望微波消融联合免疫治疗等方法在肿瘤治疗中的应用前景。

一、微波消融诱导肿瘤免疫原性死亡

肿瘤的免疫原性死亡是指肿瘤在发生凋亡或者坏死的过程中通过释放免疫原性分子如肿瘤抗原和危险相关模式分子(danger-associated molecular patterns,DAMPS)等诱导的免疫反应[11]。微波消融通过产生高热使肿瘤细胞坏死并释放溶酶体酶，内质网应激，组织发生缺血-再灌注损伤，产生并释放钙网蛋白(calreticulin,CRT)，增强抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)对肿瘤细胞抗原的摄取和处理，三磷酸腺苷(adenosine triphosphatase,ATP)招募和激活树突状细胞(dendritic cell，DC)，高表达免疫原性分子如高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box1 protein,HMGB-1)结合树突状细胞Toll 样受体4(toll-like receptor-4,TLR-4)并启动炎性反应，热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)作为分子伴侣协助APC摄取肿瘤抗原并诱导APC成熟，激活肿瘤特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL),诱导适应性免疫系统产生再一次肿瘤杀伤效应[9,12-17]

二、采用微波消融治疗肿瘤激活机体免疫效应的病理过程

1.局部炎性反应：微波消融造成的肿瘤局部高温环境使肿瘤在较短时间内发生凝固性坏死，炎性细胞释放一系列DAMPS，例如HSP，ATP和白细胞介素(interleukin,IL)等，引起局部炎性反应。有研究结果表明HSP与肿瘤抗原结合后形成复合物并释放，被APC摄取后提呈给T细胞启动免疫效应，例如单核细胞和巨噬细胞的极化[18-19]。此外，局部的炎性环境促进细胞因子如粒细胞集落刺激因子的释放，也有助于促使T细胞和APC向肿瘤组织局部浸润，发挥免疫作用[20]。Yu等[7]采用大鼠皮下骨肉瘤模型进行微波消融实验，发现外周血中晚期炎症指标HMGB-1释放增多，可作为新肿瘤抗原与TLR-4结合诱导产生炎性反应。此外，该研究者将经微波消融后的K7M2骨肉瘤细胞或UMR106骨肉瘤细胞的上清液注射到裸鼠体内，2周后皮下种植K7M2或UMR106骨肉瘤细胞，检测外周血得到HMGB-1升高的结果。尽管微波消融升温速度快，瘤内温度高，但由于消融持续时间相对较短，肿瘤抗原暴露不充分，引起的局部炎性反应及继发反应较为微弱[21-22]。以上研究结果表明，微波消融导致的凝固性坏死可引起局部炎性反应，局部的炎性因子及炎性细胞可介导抗肿瘤免疫反应，但是其具体机制仍有待探究。

2．募集活化免疫效应细胞：微波消融使肿瘤细胞在高温下产生一系列病理变化，细胞膜稳定性下降，细胞器及蛋白质变性失活暴露于细胞外环境中，被APC如DC识别并呈递给局部募集的T细胞[23]。微波消融作为一种外界热刺激，引起肿瘤细胞HSP-70表达增多，HSP-70与细胞内多肽结合形成HSP-70-多肽抗原复合物，有效激活并在消融区域富集DC和肿瘤特异性T细胞，DC的成熟和活化与肿瘤细胞释放HSP的含量直接相关[24]。有研究者对82例肝细胞癌患者采用经皮微波消融治疗癌肿结节，术后随访2～26个月，在消融及未消融区域的结节中，T细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和巨噬细胞数量显著升高，消融结节中升高更为明显[8]。对病灶局部微波消融募集CD8+T细胞也有较多研究。Chen等[25]以10 W功率对C57BL/6J小鼠肝癌模型进行癌灶微波消融，术后第10天提取小鼠脾细胞加入培养的肝癌细胞中，与对照组相比，发现肝癌细胞被杀伤，CD8+T细胞数量明显升高，提示抗肿瘤效应可能主要来源于CD8+T细胞。有研究结果表明，采用微波消融杀伤肿瘤能够募集T细胞以及其他免疫细胞如巨噬细胞、DC细胞等的抗肿瘤免疫效应和抑制肿瘤复发转移效应[16,19,26]。Leuchte等[27]对23例肝癌患者接受微波消融治疗后外周血T细胞与疾病结局的关系进行了分析，发现约30%患者经微波消融治疗后出现肿瘤相关抗原特异性T细胞反应，外周血中γ-干扰素(interferon-γ,IFNY-γ)及IL-5升高，且与患者长期缓解及更长的无进展生存期相关，经微波消融治疗后肿瘤局部T细胞浸润明显增多。

3.激活抗肿瘤适应性免疫：经微波消融治疗后发生坏死或者亚坏死的骨肿瘤细胞能够活化特异性T细胞，例如CD4+和CD8+T细胞，使机体产生适应性免疫反应，同时建立抗肿瘤记忆性免疫，控制局部肿瘤生长及复发，减少肿瘤远处转移[28]。对实体肿瘤进行微波消融治疗后，肿瘤细胞微观表现为细胞膜破裂、蛋白质等多种分子变性以及细胞骨架和代谢过程发生改变。诸多基因和分子水平的病理改变状态被称为肿瘤变异负荷[29-30]。不同亚型的肿瘤抗原或突变多肽成为肿瘤微环境中适应性免疫的起点，APC将不同的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞和其他细胞，不同类型T细胞进一步分化成熟，产生直接性抗肿瘤免疫或记忆性免疫应答[31]。在进行微波消融治疗后，之前处于亚坏死状态的肿瘤细胞向坏死发展，不断成为肿瘤新抗原或突变多肽的来源，记忆性淋巴细胞可多次分化、识别并产生抗肿瘤效应。因此，保持并延长记忆性淋巴细胞的抗肿瘤活性，对抑制载瘤患者的肿瘤复发、远处转移及改善远期生存质量均有重大意义。

4.间接逆转局部肿瘤免疫耐受：抑制调节性T细胞(regulatoy T cell,Treg)被认为可逆转肿瘤免疫耐受。Treg分布在许多恶性肿瘤及周围组织中，能够调节CD8+或CD4+T细胞，导致抗肿瘤免疫效应的减弱。关于Treg与卵巢癌、胃肠道恶性肿瘤和肝细胞癌等恶性肿瘤的进展和预后的关系已有较多研究，有临床相关性研究和功能研究结果表明CD8+T细胞与Treg比值的升高与恶性肿瘤患者的预后不良和治疗耐受相关，而且该项指标对患者预后不良预测的准确性高于单纯的Treg数量值[4,32-33]。微波消融联合免疫疗法抑制Treg逆转局部肿瘤免疫耐受的潜力有望改善日益增多的耐受免疫治疗和化学治疗的恶性肿瘤患者的现状，但其具体机制仍需要深入的研究。骨肉瘤等高度恶性骨肿瘤患者的微波消融治疗也是目前研究的重点方向。

三、肿瘤的微波消融联合免疫治疗研究现状

1.临床研究：已有临床应用微波消融联合免疫治疗提高患者抗肿瘤免疫功能的研究报道。过继细胞免疫治疗是指提取并分离自体或异体免疫细胞，在进行体外修饰扩增后输注至肿瘤患者体内以增强患者机体免疫功能[35]。有研究者通过将过继细胞免疫治疗与微波消融相结合实现抗肿瘤效应。Yu等[15]对29例肝癌患者分别行微波消融和微波消融联合免疫治疗，对联合免疫治疗组患者分别在微波消融术后第9天、12天、15天、1个月和3个月进行双侧腹股沟淋巴结注射负载肿瘤裂解物的髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells，MDC)、腹腔注射树突状淋巴细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK)和静脉注射细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)，结果表明，联合免疫治疗组患者外周血杀伤性T细胞亚群的比值(CD3+/CD8+和CD8+CD28+/CD3+CD16+CD56+)升高，而负性调节和辅助性T细胞亚群(CD4+CD8+，CD4+和CD4+CD25+)比例下降。免疫检查点是免疫反应过程中具有抑制免疫反应作用的位点，阻滞该位点可激活T细胞的活性[35]。Xie等[9]采用微波消融联合抗CTLA-4抗体(tremelimumab)治疗16例晚期胆管癌患者，其中2例得到部分缓解，5例实现了疾病稳定。微波消融联合经典免疫疗法及免疫佐剂可促进机体产生抗肿瘤免疫效应，在肿瘤患者的临床治疗中具有重大意义，但联合免疫治疗药物的应用时机和剂量等序贯治疗的策略需进一步研究。

2.基础研究：Zhu等[36]依据实验方法将乳腺癌模型小鼠分为对照组、微波消融组、抗PD-1抗体联合抗CTLA-4抗体组、微波消融联合抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体组分别进行处理，结果表明，微波消融联合抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体组显著延长小鼠生存期，同时小鼠外周血和肿瘤组织中的CD8+T细胞数量以及血浆中IFN-γ浓度明显升高；治疗后再对4组小鼠分别注射等量的乳腺癌细胞，发现微波消融联合抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体组明显延迟了乳腺癌细胞的生长。Li等[23]依据实验方法将乳腺癌模型小鼠分为对照组、微波消融组、免疫激活剂OK-432组、微波消融联合OK-432组，结果表明微波消融联合OK-432组小鼠的生存期得到显著延长，肿瘤组织内浸润的CD8+T细胞数量增加，消融后第25天对4组小鼠分别注射等量的乳腺癌细胞，发现微波消融联合OK-432组中83%(5/6)小鼠完全排斥外源性肿瘤，而其他组小鼠均出现新发体积不等的肿瘤。Wu等[37]采用微波消融和微波消融联合细胞因子缓释微球(cytokine sustained-release microspheres，cytoMPS)对肝癌模型小鼠进行实验，结果表明联合治疗组CD4+与CD8+的比例以及CTL细胞对肝癌细胞的杀伤效应均明显提高。Zhou等[38]联合应用微波消融与甘露糖碳点材料对小鼠肝癌模型进行实验研究，对小鼠肝癌模型进行微波消融处理后注入甘露糖碳点材料，能够检测到甘露糖碳点材料特异性摄取肿瘤相关抗原并呈递给DC，产生抗肿瘤免疫效应。肿瘤主动特异性免疫治疗(active specific immunotherapy,ASI)是采用经过处理的肿瘤细胞或细胞裂解物制成疫苗，对肿瘤患者予以接种从而获得免疫反应[39]。Yu等[7]采用微波消融处理大鼠和小鼠的骨肉瘤细胞悬液，并取消融后的肿瘤细胞及上清液接种至大鼠和小鼠体内，二次接种同种骨肉瘤细胞后发现，血中IFN-γ和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)浓度升高并刺激CD8+T细胞生成，诱导有效的免疫反应抵抗骨肉瘤细胞的侵袭。建立并应用不同的肿瘤动物模型，可根据临床需求对微波消融联合不同免疫方法治疗肿瘤的策略进行深入研究，有利于治疗方法在临床中得到安全有效的推广和应用。

四、微波消融治疗肿瘤存在的问题与未来应用的展望

1.存在的问题：随着微波消融在肿瘤治疗中的广泛应用，其免疫效应逐渐被重视并得到深入研究。有研究者指出，在消融过程中将肿瘤细胞控制于中低温状态即可发生肿瘤细胞控制性坏死，这是微波消融激发免疫效应的理想状态，在这种状态下部分肿瘤细胞即刻凋亡坏死，部分亚坏死状态肿瘤细胞持续向坏死细胞转归，不断释放免疫原性分子，可产生持续稳定的免疫效应[40]。

然而，微波消融手术操作在微波功率、消融时间和温度控制等方面尚缺乏统一量化的标准，导致微波消融治疗后肿瘤细胞状态不稳定，处于凋亡、坏死和亚坏死状态的肿瘤细胞比例不同，所释放的肿瘤免疫原性抗原差异较大，因此所调动免疫系统产生的抗肿瘤免疫效应程度不一，无法对治疗方法逆转局部肿瘤免疫耐受的能力进行评估[12]。如果把热疗技术作为活化机体抗肿瘤免疫反应的单一治疗方式，所引发的抗肿瘤效应较弱[25,41]。不同种类肿瘤的肿瘤负荷差异较大，经过微波消融激发的抗肿瘤免疫效应也无法得到准确的评估[26]。尽管对微波消融联合免疫疗法如化学治疗、免疫检查点抑制和细胞因子治疗等[42]临床前实验建模的评估已经实现，但如何更好地联合使用两种疗法实现消融后抗肿瘤免疫效应最大化和持久化以及治疗可能存在哪些不良反应等问题仍然需要进一步研究。

2.未来应用的展望：探索微波消融治疗肿瘤激发机体抗肿瘤效应的免疫机制，联合应用微波消融与其他治疗方法，如免疫治疗等，有利于提高肿瘤患者的临床治疗效果和推动微波消融在临床治疗中的规范应用。微波消融属于热应激，可引起与温度变化相关的特异性分子变化。有研究结果表明，热休克转录因子和热休克蛋白均与肿瘤的局部复发和远处转移等有密切的联系[43]。此外，尽管免疫治疗如PD-1抑制剂的应用在许多恶性肿瘤的治疗中取得了一定效果，但只有20%～30%患者从中获益[44]。随着恶性肿瘤转移发生率不断升高，采用微波消融治疗转移瘤，联合应用微波消融和免疫疗法增强免疫效应治疗转移及原发肿瘤，有望使更多肿瘤患者获益。

与其他外科治疗手段相比，微波消融治疗具有基于热刺激的非热效应，可获得基于局部治疗的系统性反应，在获得良好的近期临床治疗效果的同时，其远期治疗效果也应得到更多关注。在未来的研究中，采用微波消融结合生物材料以及联合免疫检查点抑制剂等增强机体抗肿瘤免疫效应的方法，杀伤原位肿瘤的同时对抗肿瘤的远处转移，将可能成为治疗肿瘤特别是恶性转移瘤的有效方法。微波消融激发的免疫效应存在巨大的临床应用潜力，对其免疫效应产生机制的探索有利于推动微波消融及其联合疗法的临床应用。