恒温荧光法快速试剂盒检测南美白对虾六种流行病病原要点

文/叶红梅 李慧

天津市水产技术推广站在2017年～2019年3年间使用恒温荧光法快速试剂盒，对本市养殖南美白对虾9个区的养殖企业及养殖户送检与抽检的种虾、虾苗、养殖过程中不同阶段的虾，进行了6种流行病病原指标检测。恒温荧光法准确率高，可有效缩短检测时间，在病害防治中能起到关键作用，有效推动当地水产养殖绿色健康发展。

近年来，南美白对虾养殖已成为天津市水产养殖的支柱产业，但由于虾苗质量参差不齐、养殖密度高、饲料品质低及投喂不当等因素，造成对虾养殖病害不断发生，给企业及养殖户造成不小的损失。在整个养殖周期中，买到优质健康的虾苗、保持稳定的水环境及虾病防控已成为南美白对虾健康养殖的关键环节。

针对当地南美白对虾养殖中常见发病情况，确定出流行病原监测指标6项，其中病毒指标4项：对虾白斑综合征（White spot syndrome virus，WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）、对虾偷死病（Covert mortality nodavirus，CMNV）和虾血细胞虹彩病毒病（Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIN）（2019年新增检测指标）；细菌类指标1项：急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）/早期死亡综合征（EMS）；寄生虫类指标1项：虾肝肠胞虫病（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。

一、快速试剂盒法（恒温荧光法）

笔者单位对南美白对虾六种流行病原指标检测采用了快速试剂盒法。快速试剂盒法（恒温荧光法）病原检测包括核酸提取和检测，提取和检测分别按照试剂盒说明书进行。采用试剂盒为广州迪澳生物科技有限公司生产，用水产动物病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的核酸可用于上述4种病毒检测，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的核酸可用于细菌AHPND/EMS和寄生虫EHP检测。

（一）试剂盒保存条件及保质期

1.提取试剂盒

水生动物病毒基因组D N A/R N A 提取试剂盒组份可在室温下（15℃～25℃）干燥保存12个月，长期保存时要置于2℃～8℃的环境中。细菌基因组DNA提取试剂盒中蛋白酶K（Proteinase k）干粉和溶菌酶（Lysozyme）干粉需要保存在-20℃的环境中，其余试剂可在室温下（15℃～25℃）干燥保存12个月，长期保存时应置于2℃～8℃的环境中。

2.检测试剂盒

恒温荧光法核酸检测试剂盒保存温度在-18℃～-25℃，有条件的可-80℃低温保存，有效期为12个月。

（二）检测样品的制备

核酸检测试剂盒法（恒温荧光法）检测要全程在卫生洁净的环境中进行，实验需要使用的工具如剪刀、镊子、纱布、生理盐水等要经过灭菌处理，枪头、离心管要无菌成品。实验时实验人员全程穿工作服，戴一次性手套。实验过程应在生物安全柜中进行，没有生物安全柜的可划定专门区域，保证该区域干净整洁无污染。实验产生的所有废弃物需进行无害化处理。

1.鲜活的虾样：将从池塘中打捞的虾放入干净的塑料袋中或塑料瓶中，放入一定的养殖水，有条件的可以在袋内充氧，保证运输到实验室的虾为活体。用多层纱布滤掉虾体水分后将其放入干净的塑料袋或离心管中，编号备检。大一点的虾用剪刀剪去眼柄后，取包含肝胰腺组织的虾头部分进行检测，不能马上检测的要放入低温冰箱中保存。

2.濒临死亡的病虾：对于在池塘中已有发病症状但不能马上拿到实验室检测的虾，养殖户可将其打捞后放到干净的矿泉水瓶或塑料袋中低温冷冻保存，做好标记，实验前将其解冻，剪去眼柄后虾头留待检测。

（三）虾样基因的提取

提取过程要在环境整洁、器皿洁净下进行。因使用试剂纯度较高，试验人员操作要准确。

1.水生动物病毒基因组（DNA/RNA）的提取：将制备的虾样按照所购试剂公司试验操作规程进行提取。病毒基因组提取后的DNA/RNA如暂时不检测要放入低温冰箱中-80℃保存，一周内尽快检测。另外因为提取后的病毒基因组核酸溶液要做4项病毒检测，因此加入的DEPC水要取50μL以保证足够的提取量。

2.细菌基因（DNA）提取：按照说明书操作规程进行提取。不同于病毒基因提取的是其消化时间较长，经过碎化处理的虾样加入缓冲物（Buffei STE和 SDS）及蛋白酶K后，一般水浴3小时消化完全。提取的DNA保存于2℃～8℃，长期保存需低于-20℃。

（四）检测

以提取的DNA作为模板，加入核酸检测试剂盒中的反应液、聚合酶、密封液后，分别进行WSSV、IHHNV、AHPND/EMS、EHP特异性PCR检测，并设置阳性对照、阴性对照。检测“对虾血细胞虹彩病毒”及“对虾偷死野田村病毒”2种病毒时需要在提取的DNA模板中加入逆转录酶得到cDNA后再进行上述操作。检测仪器采用恒温扩增荧光检测仪。

检测原理是采用恒温扩增技术，通过聚合酶及特异性引物在恒温条件下对病原核酸片段进行特异性扩增，扩增产物（DNA）与核酸染料结合后发出荧光信号，根据所产生的扩增曲线判断结果。

需要特别注意是太阳光不能直射检测机器，防止强光下仪器将阴性样品检测出假阳性。可拉上窗帘做遮光处理。

各病原指标上机检测所需体积及扩增温度、反应时间见表1。

表1 病原指标上机检测所需各种试液体积及扩增温度、反应时间

除虾血细胞虹彩病毒（SHIV）和虾肝肠胞虫（EHP）反应时间为45分钟，其余4项指标反应时间为60分钟。

二、检测结果与讨论

笔者3年间共检测南美白对虾虾样401个，包括虾苗及养殖中不同阶段的虾。

（一）年度阳性样品检出率为：

2017年为IHHNV>AHPND/EMS>EHP>WSSV>CMNV，IHHNV阳性检出率最高；2018年为EHP>IHHNV>AHPND/EMS>CMNV>WSSV，EHP检出率最高；2019年为HP>AHPND/EMS>CMNV>IHHNV>WSSV，EHP检出率最高。2018年、2019年虾肝肠胞虫（EHP）检出率高，说明种虾本身携带EHP病原，孵化时垂直传播给虾苗或孵化池消毒不彻底水体中病毒水平传播给虾苗。

（二）3年间阳性样品检出率

1.WSSV：17.8%（2017年）>16.3%（2019年）>15.1%（2018年），3年内都有检出，但变化不大；

2.IHHNV：49.5%（2017年）>25.6%（2018年）>18.3%（2019年），3年内呈逐年下降的趋势；

3.CMNV：15.0%（2017年）＜17.4%（2018年）＜25.5%（2019年），3年内呈逐年上升的趋势。

4.SHIV：2019才开始检测SHIV。因为只检测34个样品，显示阳性样品4个，检出率11.8%。出现的阳性样品是同一家单位且同一个池塘的2种虾样（小龙虾和南美白对虾），经过复检仍为阳性，说明此病毒出现几率少但可以水平传播；

5.AHPND/EMS：32.7%（2017年）>24.4%（2018年）>22.6%（2019年），3年内呈逐年下降的趋势；

6.EHP：19.6%（2017年）＜30.2%（2018年）＜30.8%（2019年），3年内呈逐年上升的趋势。

对虾偷死病（CMNV）和虾肝肠胞虫病（EHP）这2种病原阳性检出率呈上升趋势，养殖企业和养殖户今后应密切注意。如养殖前期选苗应注意EHP检测结果，一旦检出阳性应果断弃用，避免前期投入人力物力，养殖后期经济效益低。我们在检测实践中发现，被送检的样品大部分为虾苗，这说明养殖企业和养殖户越来越重视养殖前虾苗的选择，同时也充分证明了虾苗检测的重要性。

三、结论

笔者经过多年检测经验证明，用快速试剂盒法检测南美白对虾流行病病原定性准确，准确率高。并且应用此方法可缩短检测时间，尤其在养殖初期选苗阶段，在养殖企业及养殖户送检的虾样较多、选苗时间较短的情况下，检测人员可在短时间内完成检测，检测结果能够及时反馈给养殖户，使他们及时淘汰病苗、劣质苗，避免产生经济损失。另外在养殖后期由于检测时间短，可帮助养殖户及时判断病虾发病种类，为养殖户做好病害防治起到关键作用。