益肾通脉方改善脑缺血再灌注大鼠神经功能初步研究

郭延林 张树泉 王小亮

山东省泰安市中医医院脑病科,山东 泰安 271000

脑梗死为临床常见多发疾病，是我国发病率、致残率、病死率最高的疾病之一，给家庭和社会带来了极大的负担。超早期静脉溶栓和机械取栓治疗是目前急性脑梗死具有循证医学证据的治疗方法，脑血管再通治疗可挽救“缺血半暗带”，使其向正常组织转化或稳定不继续恶化[1]。超早期血管开通治疗后可通过“氧化应激”“炎性反应”等多种渠道发生“缺血-再灌注(I/R)”损伤[2]，加重脑组织损伤，导致神经功能缺损加重。因此，如何减轻和改善脑缺血再灌注损伤成为脑梗死患者脑血管开通治疗后的又一严峻挑战。中医药在脑梗死的治疗中积累了丰富的经验，为探索中医药改善脑缺血再灌注损伤的效果和作用机制，在前期临床研究的基础上，本研究采用益肾通脉方干预脑缺血再灌注大鼠，观察其神经功能缺损情况和相关血液学指标，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，体质量260～280 g，购自山东中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK-(鲁)2019-0005。

1.2 药物与制剂 益肾通脉方(制首乌20 g，山茱萸15 g，肉苁蓉15 g， 炒山药15 g，麦冬15 g，石斛15 g，五味子5 g，菖蒲10 g，郁金10 g，茯苓30 g，当归30 g，川芎30 g，全蝎10 g，益母草30 g，炙甘草5 g)，由泰安市中医医院药剂科北京康仁堂颗粒药房提供。分别加蒸馏水制成低剂量(1 mL含2.5 g生药)、高剂量(1 mL含5 g生药)的混悬液。

1.3 方法

1.3.1 分组 所有大鼠随机分为假手术组、模型组、益肾通脉低剂量组和益肾通脉高剂量组4组，各10只。

1.3.2 模型制作 模型组、益肾通脉低剂量组和益肾通脉高剂量组参照Zea Longa[3]采用线栓法制作脑缺血再灌注模型：术前动物禁食禁水 12 h，称质量后腹腔注射水合氯醛(3.0 mL/kg)麻醉，待大鼠麻醉后固定，用电动剃须刀清理颈胸部鼠毛，碘伏消毒，切开皮肤，逐层分离直至暴露右侧的颈总动脉(CCA)和迷走神经，再依次分离暴露CCA分叉部，颈内动脉(ICA)，颈外动脉(ECA)，后将尼龙缝合线从CCA插入ICA并向前推动，以阻断至左大脑中动脉(MCA)直至出现轻微阻力，脑缺血1 h后拔出线栓进行缺血再灌注。假手术组只进行血管神经分离，不插入线栓。判断造模成功标准：①悬尾实验不能完全伸展对侧前爪；②前肢抵抗对侧推力能力下降；③出现追尾现象。出现上述症状之一即为造模成功。

1.3.3 给药治疗 造模成功24 h后，益肾通脉低剂量组、益肾通脉高剂量组分别给予低剂量混悬液、高剂量混悬液各2 mL；假手术组和模型组给予2 mL的蒸馏水。每日1次，给药治疗时间为3 d。

1.4 观察指标

1.4.1 神经功能评定 实验开始后，采取改良Bederson评分法[4]每天对大鼠的神经功能损伤程度进行评分：总分4分，其中无明显损伤记0分；受损脑对侧前肢蜷缩，不能完全伸展记1分；向受损脑的对侧转圈记2分；向受损脑的对侧倾斜记3分；身体瘫软且无意识记4分。神经功能损伤程度随分值增大而加重。

1.4.2 血液学指标 实验结束后，经腹主动脉取血静置，分离血清，分别测定血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、内皮素-1(ET-1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、一氧化氮(NO)水平。

2 结果

2.1 益肾通脉方对大鼠神经功能缺损的影响 假手术组大鼠由于并未进行动脉栓塞，故未出现脑梗死缺血症状，在7、14 d神经功能缺损评分均为0分。模型组大鼠7、14 d神经功能缺损评分均明显高于其他组，差异均有统计学意义(P<0.05);随着益肾通脉方剂量的增加，大鼠神经功能缺损评分逐渐降低，且在7、14 d各剂量益肾通脉方组大鼠神经功能缺损评分均明显低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示益肾通脉方在改善脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损方面起到显著作用。见表1。

表1 四组大鼠神经功能缺损评分比较

2.2 血液学指标的变化 通过不同的试剂盒对血液指标的检测发现，与假手术组比较，在其他三组大鼠体内，MDA，HIF-1α，ET-1，eNOS和NO的含量均增加了，而SOD的含量出现降低。MDA和NO的含量在四组中的变化均不明显。与假手术组相比，SOD的含量在模型组和益肾通脉低剂量组中显著下降(P<0.05)，HIF-1α、ET-1在其他三组中显著增加(P<0.05)，eNOS的含量在模型组和益肾通脉低剂量组中显著下降(P<0.05)。与模型组比较，SOD的含量在益肾通脉高剂量组中显著升高(P<0.05)，HIF-1α、eNOS的含量在益肾通脉高剂量组中显著减少(P<0.05)。这些结果表明，益肾通脉处方对缺血再灌注大鼠血清SOD，HIF-1α和eNOS的含量均显示出显著的改善作用，但对ET-1的含量影响不显著。见表2、表3、图1。

表2 四组大鼠血清MDA、SOD、HIF-1α比较

表3 四组大鼠血清ET-1、eNOS、NO比较

图1 四组大鼠血液学指标比较

3 讨论

脑梗死即缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)是由于脑血管狭窄或闭塞,脑组织因血流消失处于缺血、缺氧状态,后期出现脑组织坏死软化,从而导致神经功能缺损的一类疾病,具有高发病率、高致死致残率、高复发率等特点,严重威胁人民健康。随着静脉溶栓技术、脑血管支架成形术、血管内机械取栓治疗水平的提高，脑血管得以再通的同时，脑缺血再灌注损伤也越来越成为学术界关注的重点和热点。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是脑缺血一定时间后，再次恢复血液供应时,通过级联反应对脑组织造成的再次损伤，常导致神经功能缺损、脑梗死和脑水肿等并发症的出现，严重者可出现脑出血,引起严重功能障碍。缺氧情况下星形胶质细胞释放炎症介质,缺血再灌注后脑组织内渗入血液系统成分,引发血源性水肿,从而使得体内超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、血清白介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)等表达上调[5]。SOD活性表明机体抗氧化能力,MDA表明细胞受损伤程度,而NO参与缺血性损伤的病理机制，IL是脑缺血急性期的重要炎症介质，TNF在脑缺血再灌注后诱导的白细胞浸润和组织损伤中发挥重要作用。ET-1是血管活动的重要调节因子之一，具有强效的调节血管收缩作用，其参与新生血管生成和血管重塑，促进细胞外基质合成，尤其在血栓性疾病的病理改变过程中发挥着重要的调节作用[6]。HIF-1α是脑组织缺血、缺氧状态的重要信号分子，对缺血缺氧环境中组织细胞的能量代谢、血管舒缩功能、炎症反应、血管再生以及细胞衰亡等方面具有提示作用[7]。

本课题组在研读历代医家理论经验记载和最新医学研究进展的基础上，结合自身临床体会，逐步形成了“以传统中医辨证论治为主线，充分利用现代科技，以取象比类的思维方式，全面实现中医现代化”的学术思想，在此指导下，把传统中医病机与现代病理结合，传统中药功效与现代药理结合，采用中医传统辨证与现代微观辨证相结合的辨证方法，积极开展缺血性中风的理论与临床研究。基于传统医学与现代医学认识，本课题组提出脑梗死的发生,是由于肾虚痰瘀内生或其他因素致生痰瘀,阻于脑络而发。脑组织缺血坏死可视为肾虚脑消髓减的微观指征, 核心梗死周围缺血半暗带可视为血瘀的微观指征, 梗死周围水肿可视为痰阻的微观指征。因此，本学科提出肾虚血瘀痰阻是急性脑梗死的重要病机, 补肾活血化痰是急性脑梗死的基本治法[8]。据此理论，本课题组拟定益肾通脉方，应用于急性脑梗死患者，前期临床研究[9]发现，使用益肾通脉方治疗急性脑梗死，可加速水肿消退，改善神经功能缺损，提高日常生活能力，减轻残障程度。

本研究结果显示：采用益肾通脉方干预脑缺血再灌注大鼠，可很好地改善神经功能缺损，升高血清SOD水平，降低血清HIF-1α和eNOS含量，提示益肾通脉方改善脑缺血再灌注大鼠神经功能的作用机制可能与抗氧化、减轻炎症反应有关，在一定程度上可起到脑保护作用。本研究仍存在一些不足，比如样本量较少导致部分检测指标没有出现显著差异，只进行了单一时间点检测、未开展时间-效果关系分析等，在今后的研究中当进一步完善。