脊柱结核患者血清特异性循环miRNA表达水平及其临床意义

黄志刚，马克，刘晶

深圳市第三人民医院骨科，广东 深圳 518100

脊柱结核是临床上最为常见的肺外结核病，而青壮年是脊柱结核的主要发患者群。脊柱结核发展到晚期时通常会发生脊柱畸形和脊髓神经功能损伤，对患者的日后生活造成严重影响[1]。脊柱结核患者的临床及影像学检查结果均无特异性表现，且缺乏特异性实验室检查指标，现有的各种诊断手段难以满足早期诊断脊柱结核的需求。

微小RNA(miRNAs)作为高度保守的非编码单链RNA分子，广泛存在于真核细胞中，在细胞的生长、分化、凋亡以及机体神经、免疫、内分泌系统的代谢过程中均能够发挥生物调节作用[2-3]。有研究表明，结核病患者的体内存在miRNAs 的异常表达，可能与结核病的发生、发展密切相关，差异化表达的miRNAs可作为早期诊断结核病的生物学指标应用于临床[4]。为此，本研究从脊柱结核患者的外周血血清寻找存在差异化表达的miRNA，通过对比其在脊柱结核患者手术治疗前后的表达变化，旨在探讨将其作为早期诊断脊柱结核病和评价临床疗效的有效标志物的可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年6月至2018年9月在深圳市第三人民医院住院治疗的50例脊柱结核患者作为观察组，其中男性29 例，女性21 例；年龄25～51 岁，平均(41.83±7.95)岁。纳入标准：(1)经手术或穿刺明确证实为活动期脊柱结核，并最终在本院完成手术治疗，病灶彻底清除，术后1年内完全治愈；(2)同时具备有较大寒性脓肿、严重骨质破坏者；(3)结核杆菌培养阳性，和/或病理学检查显示干酪样物质者；(4)排除合并脊柱外结核者。选取同期在我院体检的50例健康志愿者50例作为对照组，其中男性31例，女性19例；年龄28～49岁，平均(42.02±8.21)岁。所有对照组受检者结核菌素(PPD)试验与IFN-γ Elispot 检测结果均为阴性。两组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受检者均详细知情并签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及提取miRNAs 采用血清收集管采集观察组患者术前、术后1 年以及对照组受检者的空腹外周血各2.5 mL，室温下静置1 h 至血液凝固。之后将凝固的新鲜外周血在4℃的环境下进行离心10 min(1 700×g)，收集上层血清，期间注意避免触及血凝块，之后将采集的血清在4℃环境下再次离心10 min(2 000×g)取上清液，经低速离心去除沉淀成分后将血清置于-20℃或-80℃冰箱中保存待测。采用mirVanaTMPARISTMKit将循环miRNAs提取出来，质检miRNAs，并检测其完整性。

1.2.2 筛选miRNAs 对芯片进行预杂交，吸除后注入杂交液，置入杂交炉中，并旋转杂交。按照芯片数目，分装后，将杂交液移除，根据芯片类型不同，注入同等体积的Wash Buffer A，清洗染色，扫描芯片，扫描时间由芯片类型不同而异，一般在5～15 min。聚类分析miRNAs 基因芯片。比较组间结果，按照差异倍数≥2倍，P＜0.05，筛选有显著差异的miRNAs。

1.2.3 qRT-PCR 验证 采用实时定量PCR 扩增(qRT-PCR)技术，分别检测miRNAs的表达水平。采用茎环结构的MegaplexTMRNA 逆转录引物混合物进行。针对每一miRNA，设计反向引物，混合后再进行逆转录，获得含相同茎环结构的总cDNA混合物，最后行PCR反应成功扩增，形成22 bp左右成熟体miRNA。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差()表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNAs 的表达谱芯片及qRT-PCR 验证分析 筛选出17 个有显著性差异的miRNA，见表1，其中显著下调的miRNA有16个，显著上调的miRNA有1个。聚类分析后，获得聚类分析热图，见图1。

表1 miRNAs的表达谱芯片及qRT-PCR验证分析

图1 miRNAs聚类分析热图

2.2 两组受检者的血清特异性循环miRNAs 表达水平比较 观察组患者术前的hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-532-5p 表达水平明显低于对照组，hsa-miR-210-3p 表达水平明显高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.3 手术前后脊柱结核患者的血清特异性循环miRNAs 表达水平比较 观察组患者在术后1 年的hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-532-5p 表达水平明显高于术前，hsa-miR-210-3p 表达水平明显低于术前，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表2 两组受检者的血清特异性循环miRNAs表达水平比较()

表2 两组受检者的血清特异性循环miRNAs表达水平比较()

组别观察组对照组t值P值例数50 50 hsa-miR-30c-5p 1.48±0.45 11.35±3.08 22.422＜0.05 hsa-miR-432-5p 1.67±0.32 4.72±1.13 18.364＜0.05 hsa-miR-192-5p 1.84±0.43 5.29±1.49 15.731＜0.05 hsa-miR-532-5p 1.49±0.35 4.11±1.28 13.961＜0.05 hsa-miR-210-3p 3.92±1.34 1.28±0.31 13.573＜0.05

表3 手术前后患者血清特异性循环miRNAs表达水平比较()

表3 手术前后患者血清特异性循环miRNAs表达水平比较()

时间术前术后1年t值P值例数50 50 hsa-miR-30c-5p 1.48±0.45 10.31±2.29 26.754＜0.05 hsa-miR-432-5p 1.67±0.32 4.01±1.22 13.119＜0.05 hsa-miR-192-5p 1.84±0.43 4.69±1.17 16.167＜0.05 hsa-miR-532-5p 1.49±0.35 3.52±0.87 15.307＜0.05 hsa-miR-210-3p 3.92±1.34 1.86±0.47 10.258＜0.05

2.4 不同miRNA 表达对脊柱结核的诊断效能 hsa-miR-30c-5p 诊断脊柱结核的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值明显高于hsa-miR-432-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-532-5p和hsa-miR-210-3p，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 不同miRNA表达对脊柱结核的诊断效能

3 讨论

临床研究发现，脊柱结核主要通过临床表现、影像学表现及各类结核病等实验室检查进行综合性诊断。然而，脊柱结核患者的各项临床表现以及相关影像学特征与化脓性感染、真菌性感染以及骨肿瘤类似，诊断准确度较低。细菌培养作为临床诊断结核病的重要方式，其在脊柱结核的阳性率仅有50%左右，且检查过程耗时较长(6～8周)，难以在术前获得培养标本[5]。多种因素导致细菌培养在诊断脊柱结核上的效果并不理想[6]，目前尚无特异性诊断脊柱结核的方法[7]。因此，快速、简便、特异性和敏感性高的诊断措施十分迫切。

近年来研究证实，miRNA不仅参与了细胞的多个生理生化过程，同时在癌症、感染及自身免疫疾病多种疾病中也发挥着较为重要的作用[8-10]。与细胞内miRNA相比，循环miRNA具有更好的生物学特性，可应用于肺结核以及其他多种疾病的临床诊断中，是一种较为理想的生物标记物[11-13]。

本研究在脊柱结核病患者血清中筛选出17 个有显著的差异表达的miRNA，经过qRT-PCR 验证，有5个表达量显著异常。通过对比两组受检者以及脊柱结核患者在手术前后的血清特异性循环miRNAs表达水平发现，患者术前的4个miRNA表达水平明显低于健康体检者，剩余1 个的表达水平明显高于健康体检者。脊柱结核在术后1年的4个miRNA表达水平明显高于术前，剩余1个的表达水平明显低于术前，与芯片结果一致。通过对上述的5个miRNAs靶基因进行预测，hsa-miR-30c-5p 与脊柱结核密切相关，在骨代谢中发挥较为重要的作用。hsa-miR-30c 的潜在靶基因为分别为FLT1、CXCL12、RUNX2，分别负责干细胞特性维持、MSC表型和成骨分化[14-16]。

本研究对上述5 个miRNA 在诊断脊柱结核上的诊断效能进行比较，结果显示，hsa-miR-30c-5p 诊断的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为100.00%、96.00%、98.00%、96.15%和100.00%，均明显高于其余四个miRNA。上述5 个miRNA 中，hsa-miR-30c-5p 在诊断脊柱结核上的诊断效能最佳，其差异化表达的循环miRNAs可作为诊断的生物标志物应用于临床。

综上所述，脊柱结核存在特异性表达的循环miRNAs，差异化表达的miRNAs对于进一步从分子角度研究脊柱结核的病理机制、病情发展有重要作用。