模拟氮沉降对杉木丛枝菌根真菌侵染率和球囊霉素的影响

汪鹞雄,李 全,沈益康,杨 强,张君波,王艳红,宋新章

浙江农林大学,省部共建亚热带森林培育国家重点实验室, 杭州 311300

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是土壤中分布最广泛的一类微生物组分,与农林业生产关系密切,能够与80%的高等植物形成共生关系[1]。由于AMF的菌丝比宿主植物根系更细且密度更大[1],AMF能够吸收到宿主植物根部无法触及的营养物质[2-3],能明显改善宿主植物的营养状况。而侵染率是AMF与植物共生关系紧密程度的一个重要标志[4]。球囊霉素在土壤团聚体形成过程中起到了“粘合剂”的功能,能够提高土壤结构的稳定性和减慢有机碳的分解速度,提高土壤的肥力从而改善宿主植物营养状况[5]。另外球囊霉素是由AMF的菌丝体和孢子壁层产生的一种糖蛋白,可产生于根内菌丝也可产生于根外菌丝,随着根系、菌丝和孢子的降解而进入土壤[6],是土壤有机质的重要组成部分[7],因此,球囊霉素一定程度上能反映AMF在土壤中的生存状况。球囊霉素按照提取的难易程度可分为易提取球囊霉素相关土壤蛋白(EE-GRSP)和总球囊霉素相关土壤蛋白(T-GRSP)[8]。大量研究发现土地肥力情况、土地利用方式、环境条件等均会影响AMF侵染率[9]和球囊霉素[10]的含量及分布。其中,施氮肥显著影响了AMF活性[11]。然而,关于大气氮沉降对AMF侵染率和球囊霉素的影响则鲜有报道,氮沉降与施氮肥对AMF的影响是否一致,也还需要进一步的研究。

近年来,由于工业上化石燃料的持续燃烧、农业上氮肥的大量施用、以及畜禽养殖方面产生的污染等,氮的排放量持续增加,大气中活性氮浓度逐渐升高。大气氮沉降日益增强,这种趋势已从发达地区迅速扩展到全球范围,极大影响了全球氮循环[12]。长期高强度氮沉降输入森林土壤使有机质、pH值、有效磷等呈下降趋势[13],并且导致硝酸盐流失[14-15],而这些土壤理化性质的改变也可能影响AMF活性。此前关于三叶草,大豆和洋葱的研究显示氮输入增加会显著抑制AMF侵染宿主植物[16-17],而Hepper关于莴苣的研究则与之相反[18],随着氮增加,AMF侵染率也随之显著增加。这些研究更多针对的是草本植物,且大部分是盆栽实验,而对于野外条件下木本植物与AMF共生关系的研究则极少,尤其是人工林生态系统。

杉木(Cunninghamialanceolata)作为我国最重要的森林资源之一,是我国南方栽培最广的速生树种之一,杉木木材的销售收入是南方许多地区林农主要的经济收入来源。一方面由于一些林农存在重栽疏养的现象,导致林木材质下降,经济效益不佳,林农对杉木的种植积极性下降。其次,林农为了获取更高的经济效益,砍伐杉木林转型种植经济价值更高的经济树种,从而导致杉木林面积减少[19]。因此,提高杉木木材品质对于杉木林的可持续经营有着至关重要的作用。目前,杉木林广泛种植在我国亚热带地区[20],而该地方也是我国氮沉降最严重的地区,有研究表明我国亚热带地区的最大年氮沉降量达到了6.35 g N m-2a-1[21],并且预计有进一步增加的趋势[22]。尽管学者已经对杉木进行了大量的有关氮沉降的研究,比如氮沉降对杉木幼苗的丛枝菌根真菌氮素吸收的影响[23]和氮沉降对杉木林养分分配的影响[24],但氮沉降对野外杉木AMF侵染率和球囊霉素的影响的关注较少。故本研究以杉木作为研究对象,探究氮沉降对不同季节AMF侵染率和球囊霉素影响,提出并验证以下3个假设;(1)氮沉降增加了AMF的侵染率和球囊霉素的含量;(2)季节会影响杉木AMF的侵染率和球囊霉素的含量;(3)氮沉降和季节的交互作用会影响杉木AMF的侵染率和球囊霉素含量。以期为氮沉降背景下的杉木林经营管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 样地概况

试验地(119°67′E,30°21′N)位于浙江省杭州市临安区。该区地处中亚热带季风气候区的北缘,四季分明,气候温和,雨量充沛,年均降水量1420mm左右,年均气温15.6 ℃,年均无霜期230d左右,土壤为黄壤,地形地貌为低山丘陵。

1.2 实验设计

试验样地的杉木林为10年生杉木林,选取样地内9棵长势相近的杉木,平均树高约3m,平均树冠面积约2m×2m。以杉木为中心设一个3m×3m独立小样方,每个样方四周用0.5m深的铝塑板隔开,样方相隔至少2m。模拟氮沉降处理参照国际上氮沉降模拟研究的试验方法[25-26],依据我国亚热带地区的实际氮沉降量及未来增加趋势[27],以当地氮沉降率3—3.7 g N m-2a-1为基础[28],设置2个水平：低氮(N3)为3 g N m-2a-1,高氮(N6)为6 g N m-2a-1。另外设置对照处理Control。共3个处理,每个处理3个重复,随机设置。从2017年4月起至今,每个月喷施1次,每年12次。具体方法为：每月月初将每个样方所需喷施的一定量的NH4NO3溶解在水中,利用电动喷雾器,从树冠上方往下均匀喷洒。对照处理样方喷洒同量水但不添加氮,以避免处理间因外加水而造成的影响。

1.2.1样品采集

在2019年1月和4月采集土壤和杉木根系样品。在每个样方内,以杉木基部为中心,按东西南北4 个方位,去除枯枝落叶层后,在40cm为长和宽矩形面积内,0—20 cm 土层深度范围内沿根系采集带有细根(≤2mm)的根系,用抖土法收集根系表面的土壤将其作为根际土壤[29]。土壤和根系样品均装入无菌塑料袋,置于4°C保温箱中,带回实验室。土样通过筛子(< 2mm)后自然风干,用于球囊霉素和土壤理化性质的测定。根系用自来水冲洗,然后用灭菌的超纯水冲洗,选取根径≤2mm的细根,将洗净的细根剪成1cm的根段,放入提前配好的FAA固定液(38%的福尔马林、冰醋酸、70%的酒精,三者按照体积比1∶1∶9配置)保存,用于侵染率的测定。

1.2.2AMF侵染率和球囊霉素的测定方法

侵染率的测定先采用改进的酸性品红染色法染色[30],然后用网格交叉法测定[4]。易提取球囊霉素(EE-GRSP)和总球囊霉素(T-GRSP)的提取和定量分析参考Wright等[31]和Janos等[32]的方法。

1.2.3土壤理化性质的测定方法

土壤全氮含量采用H2SO4-H2O2消煮后,半微量凯氏法测定[33]。土壤全磷含量用H2SO4-H2O2消煮后,钼锑抗比色法测定[34]。土壤有效磷用双酸法,采用[c(HCl)=0.05mol/L和c(1/2H2SO4)=0.025mol/L]的提取液提取酸溶性磷和吸附态磷,采用钼锑抗比色法,使用可见分光光度计进行测定[35]。土壤有效氮采用碱解扩散法,用1mol/L NaOH溶液水解土壤,使易水解态氮(潜在有效氮)碱解转化为NH3,NH3扩散后为硼酸吸收。硼酸吸收碱解液中的NH3后再用0.01mol/L H2SO4滴定,然后计算土壤中有效氮的含量[36]。土壤pH值,按照水土比为2.5∶1,采用便携式pH计测定(FE20,Mettler Toledo,Switzerland)[37]。

1.2.4数据分析

利用SPSS 17.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)结合最小显著差异法(LSD)比较不同氮处理下AMF侵染率、易提取球囊霉素、总球囊霉素含量和土壤有效氮磷比的差异性。采用可重复双因素方差分析(General Linear Model;GLM过程,SPSS 17.0)分析氮添加和季节及其交互作用对杉木林土壤的AMF侵染率、易提取球囊霉素、总球囊霉素和土壤有效氮磷比的影响。采用Pearson相关性分析土壤理化性质与侵染率、易提取球囊霉素和总球囊霉素的相关性。图由sigmaplot12.5软件制作,数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 杉木AMF侵染率

如图1所示,无论在冬季和春季,与对照相比,N3处理均显著增加了AMF侵染率,而N6处理无显著影响。其中,在冬季,N3处理显著增加了59.71%(P<0.05),在春季,N3处理显著增加了539.50%(P<0.05)。相同氮沉降处理下,冬季的AMF侵染率均显著高于春季,分别增加89.27%(Control),57.15%(N3)和67.68%(N6)。双因素方差分析表明氮沉降和季节均显著影响杉木AMF侵染率(表1)。

图1 不同氮沉降处理对杉木AMF侵染率的影响

2.2 杉木根际土壤易提取球囊霉素含量

如图2所示,在冬季,与对照相比,N3处理的根际土壤易提取球囊霉素含量无显著变化(P>0.05),N6处理下的根际土壤易提取球囊霉素含量显著提高了50.19%(P<0.05)。而在春季,N3相比对照显著降低了16.80%(P<0.05),N6相比对照显著降低了9.80%(P<0.05)。相同氮沉降处理下,冬季的易提取球囊霉素均显著低于春季(P<0.01),分别降低了44.78%(Control),35.55%(N3)和8.02%(N6)。双因素方差分析表明氮沉降和季节及其两者的交互作用均显著影响杉木根际土壤易提取球囊霉素含量(表1)。

图2 在不同季节不同氮沉降处理对杉木根际土壤易提取球囊霉素含量的影响

2.3 杉木根际土壤总球囊霉素含量

如图3所示,在冬季,氮沉降处理对杉木根际土壤总球囊霉素含量无显著影响(P>0.05)。在春季,N6处理下的杉木根际土壤总球囊霉素的含量比对照显著增加了22.26%(P<0.05)。相同氮添加情况下,冬季的杉木根际土壤总球囊霉素显著低于春季,其中分别降低了58.81%(Control),52.21%(N3),和60.39%(N6)。双因素方差分析表明氮沉降和季节及其两者的交互作用均显著影响杉木根际土壤总提取球囊霉素含量(表1)。

图3 在不同季节不同氮沉降处理对杉木根际土壤总球囊霉素含量的影响

2.4 杉木根际土壤有效氮磷比

如图4所示,在冬季,氮沉降处理显著增加杉木根际土壤有效氮磷比(P<0.05)。N3处理的土壤有效氮磷比比对照显著增加了42.22%(P<0.05)。在春季,氮沉降处理显著增加杉木根际土壤有效氮磷比(P<0.05)。N3处理的土壤有效氮磷比比对照显著增加了104.30%(P<0.05)。相同氮添加情况下,冬季的杉木根际土壤有效氮磷比显著高于春季,其中分别增加了759.95%(Control),498.61%(N3),和477.98%(N6)。双因素方差分析表明氮沉降和季节及其两者的交互作用均显著影响杉木根际土壤有效氮磷比(表1)。

图4 在不同季节不同氮沉降处理对杉木根际土壤有效氮磷比的影响

表1 氮沉降和季节对杉木AMF侵染率和球囊霉素的双因素方差分析

2.5 AMF的侵染率、球囊霉素含量和土壤理化性质的相关性

由表2可见,Pearson相关性分析表明,AMF侵染率与土壤有效磷有极显著负相关的关系(P<0.01),与pH值有极显著正相关关系(P<0.01),与有效氮磷比有极显著正相关关系(P<0.01)。易提取球囊霉素和总球囊霉素含量与土壤有效磷有极显著正相关关系(P<0.01),与pH值有极显著负相关关系(P<0.01),与有效氮磷比有极显著负相关关系(P<0.01)。

表2 杉木AMF侵染率,球囊霉素与土壤理化性质的相关性分析

3 讨论

3.1 氮沉降对杉木AMF侵染率和球囊霉素的影响

在冬春季节,适当的氮添加(3 g N m-2a-1)显著提高了AMF侵染率,这与我们的假设(1)一致。与Johnson等的研究结果相似[38],其研究表明在草原土壤中,氮添加显著增加了AMF侵染率。原因可能是氮添加使得植物可以利用的有效氮增加,根系吸收营养物质的方式(尤其是磷元素)无法满足植物自身的氮磷营养平衡,因此通过AMF侵染根系以便获取土壤中的有效磷[39],从而使得AMF侵染率增加[40]。相关性分析AMF侵染率与有效氮磷比显著正相关。我们的实验结果表明氮沉降显著增加了土壤有效氮磷比,间接支持了上述观点。在冬季,氮沉降增加易提取球囊霉素含量。Treseder等发现氮添加会增加AM真菌的侵染率和菌丝长度,这导致土壤中菌丝的生物量增加[41],这些根外菌丝更新或者降解后引起了土壤中易提取球囊霉素的增加[42]。而春季的易提取球囊霉素是受到氮添加的抑制的,原因可能是春季温度上升,刺激了AMF等土壤微生物的增长。更进一步研究发现,相比真菌,细菌对氮增加的更加敏感,更有利于细菌的增加,从而到导致了真菌细菌比降低[43]。同时易提取球囊霉素不稳定,容易被细菌快速分解[44],从而导致易提取球囊霉素含量低。尽管AMF侵染率提高,但在春季仍呈现出氮添加减少了易提取球囊霉素含量的现象。在冬季氮添加增加了总球囊霉素,但是未达到显著水平,而春季,氮添加显著增加了总球囊霉素含量。杉木由于氮添加,生长发育受到有效磷限制,它们可能会倾向于投资一些获取磷能力更强的AMF类群,比如巨胞囊霉科[45]。而巨胞囊霉科真菌产生的根外菌丝多于球囊霉科真菌[46],增加了根外菌丝的生物量。然而菌丝的降解需要一段时间[47],且总球囊霉素是较为稳定的球囊霉素[44],不易被微生物分解,从而直到春季氮添加才显著提高了总球囊霉素含量。由于球囊霉素是土壤团聚体形成的重要粘合剂,且土壤团聚体形成是影响土壤碳固持和碳稳定的重要机制[31]。无论在春季还是冬季,氮沉降均提高了总球囊霉素含量,表明氮沉降有利于土壤团聚体的形成,从而有利于土壤的碳稳定。可能意味着氮沉降能够减缓土壤中碳的释放,进而减少杉木林温室气体的排放。

3.2 季节变化对杉木AMF侵染率和土壤球囊霉素的影响

在对照处理下,春季的AMF侵染率显著低于冬季,支持了我们的假设(2)季节变化影响了杉木AMF的侵染率。原因可能是相比于冬季,春季温度上升,微生物活性增强,分解有机物释放出更多的营养物质,便于根系的吸收,从而减少了对AMF的依赖,进而导致AMF侵染率下降[48]。此外,侵染率和土壤有效氮磷比呈极显著正相关,春季土壤的有效氮磷比显著低于冬季,也支持了上述观点[49]。在对照处理下,春季的易提取球囊霉素和总球囊霉素含量均显著高于冬季。原因可能是春季微生物活性增强,土壤中的其他微生物与AMF竞争,AMF获得的碳源比冬季少,前一个季节产生的菌丝大量降解,因此春季的球囊霉素含量显著高于冬季[47]。鉴于球囊霉素在土壤团聚体形成中的独特作用[31],相比较冬季而言,春季更有助于土壤团聚体的形成,有助于减缓春季土壤碳的释放,也有助于减少于营养物质的淋失[50],从而保障植物养分供应。在氮添加处理下,春季的易提取球囊霉素和总球囊霉素含量均显著高于冬季,这与我们的假设(3)不一致。表明氮沉降并未改变季节因素对易提取球囊霉素和总球囊霉素的影响。

4 结论

在冬春季,氮沉降提高了杉木林AMF侵染率和土壤总球囊霉素含量。表明氮沉降使杉木与AMF的共生关系更加紧密,植物依赖于AMF吸收更多的养分,从而利于植物在逆境中的生长。在相同氮添加情况下,春季的AMF侵染率显著低于冬季,而易提取球囊霉素和总球囊霉素含量则显著高于冬季。这表明随着季节的变化,杉木对AMF的依赖度也会随之变化。在相同氮添加情况下,春季的AMF侵染率显著低于冬季,而易提取球囊霉素和总球囊霉素含量则显著高于冬季。表明在两者交互作用下,氮沉降并未改变季节因素对杉木与AMF共生关系的影响。