海南辣椒、樱桃番茄病毒病调查及病原dot-ELISA鉴定

严婉荣，赵志祥，肖彤斌，张善学，文香玲，王会芳

（1.海南省农业科学院植物保护研究所，海南 海口 571100；2.海南正业中农高科股份有限公司，海南 海口 571100）

【研究意义】2018年海南省冬季蔬菜种植面积257 728 hm2,产量566.77万t，其中辣椒种植面积408 96 hm2，产量101.52万t（据《海南统计年鉴-2019》），樱桃番茄种植面积约7 822 hm2，产量28.15万t左右［1］。辣椒大面积种植主要集中在琼海、澄迈、文昌、临高等县市，是供应内地冬季“菜篮子”的第一大蔬菜品类［2］。樱桃番茄俗称“圣女果”，重点产区分布在陵水、定安、东方、昌江等县市，仅陵水就占全省种植面积的69%。2016年，“陵水圣女果”获国家质量监督检验检疫总局“国家地理标志保护产品”认证［1］。随着辣椒和樱桃番茄多年连作、较高的复种指数以及海南优越的天气条件，导致病虫害发生严重。尤其病毒病在辣椒和樱桃番茄上普遍发生，陵水、定安主产区出现的病毒病对樱桃番茄生产造成了毁灭性的影响［3］，使产量和品质明显下降，严重影响了种植效益和农户生产积极性。【前人研究进展】国内外报道的辣椒病毒已有70种以上，我国报道的已达31种［4］，侵染番茄的病毒至少有136种［5］,我国报道的已达34种［4］。海南地区陆续也有新病毒发现，首次在海南辣椒上检测到辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）［6］和甜椒脉斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）［7］,首次在海南番茄上发现了番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）［8］。在优势毒源上，姚玉荣等报道海南辣椒的优势毒源为黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）［9］，严婉荣等［10］检测表明辣椒上的优势毒源为CMV和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV），番茄上的优势毒源为番茄黄花曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）和CMV［10］，除CMV外，辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）、PVMV、ChiVMV 3种病毒已成为海南辣椒上不可忽视的毒源［7］，番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）［11］和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）［12］已在云南番茄种植区大面积发生，海南地区应引起高度重视和警惕。【本研究切入点】通过全面系统调查，明确10个市县辣椒和樱桃番茄病毒病发生为害情况。通过dot-ELISA方法，对CMV、TMV、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）、蚕豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus,BBWV）、黄瓜绿斑驳病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）进行检测，明确其变化动态。【拟解决的关键问题】进一步明确病毒病的种类及侵染情况，为病害的诊断、药剂的筛选及综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 海南辣椒、樱桃番茄病毒病发生、为害程度调查

2018—2019年，对海口市琼山区、澄迈县永发镇、定安县定城镇深田村、临高县加来镇贤郎村，五指山市番阳镇、昌江县十月田镇、陵水县光坡镇武山村、三亚市吉阳区、琼海市潭门镇福田村和东方市感城镇10个市县的辣椒、樱桃番茄病毒病发生情况进行了抽样调查分析，调查了不同地点、不同作物时期病毒病的为害程度。每个调查田块采用五点取样法，每点取不同方位植株30株，每个田块共计调查150株，记录病害发生株数，观察每株的发病程度，辣椒病情级数调查参照《农药田间药效试验准则 第9部分杀菌剂防治辣椒病毒病》（NY/T 1464.9-2007），番茄病情级数调查参照《农药田间药效试验准则 第8部分杀菌剂防治番茄病毒病》（NY/T 1464.8-2007）。计算病毒病田间发病率和病情指数，并进行症状类型归类和统计分析。

1.2 辣椒、樱桃番茄病毒病dot-ELISA检测

1.2.1辣椒、樱桃番茄样本采集 在海口市、定安县、临高县、陵水县等市县采集到辣椒病毒病叶片样本288份，樱桃番茄病毒病叶片样本305份。

1.2.2辣椒、樱桃番茄样本dot-ELISA检测称取叶片1 g，加入10 mL 0.01 mol/L PBS研磨，8 000 r/min离心3 min；取2 uL上清点到硝酸纤维素膜（NC膜）上，室温干燥10 min后将NC膜浸入到100 mL含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液中温室封闭30 min；NC膜放入5%脱脂奶粉1∶5 000倍稀释的单抗中室温孵育60 min,PBST洗膜4次,每次3 min；NC膜放入用5%的脱脂奶粉1∶8 000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育60 min，PBST洗膜5次，每次5 min,PBS洗膜1次，5 min;用滤纸吸干膜，放入底物显色液中反应5～20 min，清水中漂洗后观察结果。底物显色液：显色底物NBT 66 uL和 BCIP 33 μL加到10 mL底物缓冲液（0.1 mol/L Tris-Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5）中混匀。检测对象包括CMV、TMV、TuMV、BBWV和CGMMV。其中NC膜购自Amersham 公司，货号RPN303C。Anti-Mouse IgG二抗购自Sigma公司，货号A3562。显色底物BCIP/NBT购自Promega公司，货号S3771。部分一抗和试验方法由浙江大学农业与生物技术学院谢艳老师提供。每种病毒的阳性对照和阴性对照购自北京莱特生物试剂公司。

2 结果与分析

2.1 病毒病发生、为害程度调查结果

10个市县辣椒和樱桃番茄病毒病发病率和病情指数见表1，调查结果显示：10个市县的症状类型主要以斑驳花叶，顶部叶片皱缩卷曲，黄花及矮缩（丛枝）为主（图1），斑驳花叶和顶部叶片皱缩卷曲症状在田间分布较均匀，植株矮缩斑驳、黄花症状多分布在田块边缘地区。在定点调查的10个地点中，陵水县光坡镇武山村和定安县定城镇深田村的樱桃番茄病毒病发生情况最为严重，病害发生率在10%～98%，病情指数在2.89～40.78，其周边地区也有大面积感染病毒病，田间烟粉虱发生严重，可能是导致病毒大面积爆发的主要传毒媒介［13-14］。临高县加来镇贤郎村和琼海潭门镇福田村的辣椒病毒病发生也比较严重，病害发生率在18%～75%，病情指数在4.44～25.69，田间蓟马爆发，可能是导致病毒病发生的主要传毒媒介［15］，海口琼山和东方感城种植的樱桃番茄和辣椒病毒病发生均较轻，病害发生率在3%～15%，病情指数在0.78～5.22（表1）。药剂防治结果均不理想，尤其在樱桃番茄上，一旦发生病毒病，传播速度很快，无药可治。不同区域病毒病发生情况不同，不同时间段病情也有差异，前期的调查发现从苗期到开花期之前病毒病发生情况较少，只有临高、琼海的辣椒和陵水的樱桃番茄有少量病害发生，发病率最高只有3%，开花期到挂果期病毒病发生情况较严重。

表1 辣椒、樱桃番茄病毒病发生情况Table 1 The occurrence of pepper and cherry tomato virus diseases

2.2 dot-ELISA检测结果

辣椒样本288份，来自海口市、澄迈县、琼海市、三亚市、五指山市、东方市和临高县。CMV、TMV、TuMV、BBWV、CGMMV的检出率分别为20.14%、7.98%、6.25%、4.17%、2.08%。其中CMV+TMV复合侵染4份，CMV+TMV+TuMV复合侵染3份，CMV+TMV+BBWV复合侵染1份，总体病毒检出率为37.5%，复合侵染率为2.08%（表2）。临高地区辣椒病毒检出率最高，达到41.38%，琼海地区检出率达到39.73%，东方地区检出率最小为21.05%。

樱桃番茄样本305份，来自海口市、澄迈县、定安县、文昌市、陵水县。CMV、TMV、TuMV、BBWV、CGMMV的检出率分别为11.48%、3.94%、3.61%、1.64%、0.66%，其中CMV+TMV复合侵染2份，CMV+BBWV复合侵染1份，总体病毒检出率为20.33%，复合侵染率为0.98%。定安和陵水地区的樱桃番茄病毒检出率较高，分别达到25.61%和25.51%，文昌地区检出率最低为8.33%，检测部分结果见图2。在检测的5种病毒中，辣椒和樱桃番茄的优势毒源均为CMV和TMV。采集的辣椒和樱桃番茄样本中，所有样本均表现出病毒症状，但大部分样本没有检测到病毒，可能与病毒检测种类不够多、检测方法及病毒变异有关。

表2 辣椒、樱桃番茄dot-ELISA检测结果Table 2 dot-ELISA test results of pepper and cherry tomato

3 讨论

在检测的5种目标病毒中，辣椒和樱桃番茄的优势毒源仍为CMV和TMV，与车海彦等［12］和严婉荣等［10］的检测结果一致。在检出率上，本研究辣椒和樱桃番茄中CMV和TMV的检出率远低于车海彦等［12］和严婉荣等［10］的检出率。辣椒上BBWV的检测情况却完全相反，2015年检出率只有0.04%，本次检测结果高达4.17%。番茄上2015年BBWV的检出率为2.77%，本次检测结果为1.64%，呈下降趋势。可能与检测方法、采样地点及病毒逐年变化有关。省外地区，洛阳辣椒中CMV的检出率只有3.03%，番茄CMV的检出率高达45.54%［16］，贵州地区辣椒中CMV、TMV、TuMV、BBWV的检出率分别为18.58%、4.35%、0.40%、0.79%，番茄中CMV、TMV、TuMV、BBWV的检出率分别为14.77%、0.57%、1.14%、1.14%，均未检测到CGMMV,存在6种类型的复合侵染［17］，除番茄中CMV的检测结果高于本研究的检测结果外，其他病毒的检测均低于本研究的检测结果，而且本研究CGMMV在辣椒和番茄中均有检测到，为在海南地区的首次报道。在优势病毒上，于海龙等［18］在全国16个省市采集辣椒样本，通过双抗体夹心酶联免疫吸附反应（DAS-ELISA）对12种辣椒样本进行检测，PMMoV和CMV为优势毒源，其中海南地区的7个样本中也只检测出2份PMMoV和2份CMV。广西地区辣椒病毒病的优势毒源为ChiVMV、PVMV、CMV［19］。湖北地区茄科蔬菜上毒源复杂，CMV、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）和BBWV是主要毒源［20］。陈灵芝等检测的甘肃辣椒中优势毒源为TMV，但未检测到CMV［21］。山东辣椒上的优势毒源为PMMoV、CMV和甜菜西方黄化病毒（Beet western yellows virus，BWYV）［22］，河南省由烟粉虱传播的TYLCV和ToCV在番茄主栽区普遍发生［14］。北京地区番茄上的优势毒源为TYLCV、TMV和CMV［23］。除CMV在全国各省普遍发生外，其他种类的优势毒源各有特点，本研究中由于检测种类的局限性，大部分样品表现病毒症状但并未检测到病毒，针对全国已报道的各省优势毒源，下一步将扩大病毒检测范围，除继续监测本研究中的几种病毒外，加大对辣椒上ChiVMV、PVMV、PMMoV、ChiRSV以及番茄上TYLCV、ToCV、TSWV、ToMV的检测。在检测方法上，采用小RNA深度测序和RT-PCR相结合的技术继续对海南地区辣椒和樱桃番茄病毒发生情况进行跟踪调查和全面检测，为有效药剂的研发与筛选、抗病品种的选育、进一步有针对性防控病毒病提供科学依据。

4 结论

本研究调查了海南辣椒和樱桃番茄病毒病总体发生情况，明确了辣椒和樱桃番茄主要种植病毒病发生率和病情指数。通过dot-ELISA方法对病毒样本进行检测，明确了288份辣椒样本和305份樱桃番茄样本中5种病毒病的总体检出率和复合侵染率。比较了2015年严婉荣等［10］通过DAS-ELISA方法和本次通过dot-ELISA对CMV、TMV、TuMV、BBWV 4种病毒检测结果的异同。同时与全国各省市辣椒和番茄病毒病发生情况进行了比较，明确了海南省与其他省市病毒检出率、复合侵染以及优势毒源的异同。综上所述，近2年海南省辣椒和和樱桃番茄主产区病毒病为害十分严重，病毒种类日趋增多，复合侵染现象日趋严重，病毒的检测和优势毒源的预测可更好地为抗病品种的筛选、靶标药剂的研发及病毒病综合防控提供策略。