两种程序在患儿静态淋巴细胞采集中的应用比较

张月梅,陈 娟,乔佳丽,尹晴雪

河北燕达陆道培医院血细胞分离室,河北廊坊 065200

细胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞特性，采用生物工程方法获得，或进行体外扩增、培养等处理后，使其具有增强免疫、杀灭病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的[1]。近年来，通过血细胞分离机采集单个核细胞，为血液病及恶性肿瘤患者实施嵌合抗原受体T细胞(CART细胞)及细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)免疫治疗，已成为治疗血液病及恶性肿瘤的重要方法[2-3]。血细胞分离机-COBE光谱一直是细胞单采术的主力，它由一个微处理器控制，在这个微处理器中抗凝血液会进入离心机，红细胞被分离到离心带外层，血浆在离心带中间，离心带另外两层则是含有白细胞和血小板的白膜层，根据血液各成分的密度差异，利用梯度离心原理将全血分离成不同成分的层面，通过界面探测器识别不同成分的血细胞后进行对应层面的提取[4]。COBE Spectra血细胞分离机的全自动采集程序(AutoPBSC程序)和半自动采集程序(MNC程序)均可提取单个核细胞，未动员的淋巴细胞可根据临床需要培养成为CART细胞或CIK细胞。本研究通过比较采集相关指标和采集物中淋巴细胞数量，探讨AutoPBSC程序与MNC程序在静态淋巴细胞采集中的应用效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2018年2月至2020年2月总血容量(TBV)为1 100～1 893 mL的患儿70例作为研究对象，其中男41例，女29例，随机分为AutoPBSC组(34例)和MNC组(36例)。AutoPBSC组患儿年龄1～10岁，平均(7.82±1.21)岁，TBV中位数为1 368.51 mL，不采用红细胞预注管路。MNC组患儿年龄2～7岁，平均(5.41±0.85)岁，TBV中位数1 501.02 mL，均采用红细胞预注管路。采集通路为外周静脉穿刺30例，股静脉置管40例。两组患儿年龄、采集前白细胞计数(WBC)、TBV、血细胞比容(HCT)比较，差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性，见表1。

表1 两组患儿一般资料比较

1.2仪器与试剂 患儿采集前血常规采用贝克曼库尔特UniCel DxH800血细胞分析仪，采集物WBC和采集物淋巴细胞百分比采用迈瑞BC-2600全自动血细胞分析仪，抗凝剂为山东威高集团医用高分子制品股份有限公司生产的血液保存液(Ⅰ)，为复方制剂，其1 000 mL的主要组分为：枸橼酸钠22.0 g、枸橼酸8.0 g、葡萄糖24.5 g。

1.3方法 (1)AutoPBSC程序静态淋巴细胞采集方法：使用6.1版软件的COBE Spectra血细胞分离机和双级充填盘,按照采集液流径指示膜安装AutoPBSC管路，初始化后输入患儿身高、体质量、HCT、WBC 、单个核细胞(MNC)%,设定循环血量为患儿2～3倍TBV,全血流速15～40 mL，收获量3 mL,追赶量7 mL,设定每500毫升收获1次，采集物终体积=(收获量+追赶量)×收获次数。(2)MNC程序静态淋巴细胞采集方法：选用单级充填盘，基本步骤同AutoPBSC程序，初始化后输入患者身高、体质量、HCT,设定循环血量为患儿2～3倍TBV,全血流速15～40 mL，MNC程序在采集界面建立时需要操作人员根据经验，通过目测比色法手控调节血浆泵流速进行淋巴细胞采集,采集物终体积为采集界面建立后至总循环血量结束对应的毫升数，为70～100 mL。(3)红细胞预注管路方法：由双人对红细胞悬液进行“四查十对”，保证输血安全；遵医嘱在输注红细胞前给予抗过敏药物；反向识别患儿及血型，采血端连接一次性输血器及三通道旋阀，为患儿慢速输注10 min，观察有无过敏反应。旋转三通阀关闭通道，开放机器与输血器通道，打开采血端白色卡子，并全部打开输血器滚动阀，运行机器，将抗凝剂与全血比例调至1∶50，速度调至30～50 mL/min,此时红细胞快速填充管路，将生理盐水排至废液袋，机器显示“Close return saline.Press CLEAR(关闭回输端盐水，请按清除键)”时，关闭回输端盐水滚动阀，按清除键后再按“暂停/继续”键，此时关闭采血端白色卡子，关闭输血器滚动阀，卸下三通旋阀，将采血端管路与采血通道连接并打开关卡，继续运行机器，根据患儿自身血小板设定抗凝剂与全血比例。此时开始采集患儿全血，机器显示快速建立界面。(4)静脉通路：COBE Spectra血细胞分离机中AutoPBSC程序和MNC程序采用双针式管路，需建立2条静脉通路，一般选用外周肘部静脉，采血端使用一次性17G采血针或18G留置针，回输端使用 20～22G静脉留置针;外周血管穿刺困难者，给予股静脉置入7F或8F中心静脉血管，采集完成后拔除。

2 结 果

2.1两组患儿采集情况比较 AutoPBSC组患儿循环量、采集时间均高于MNC组，差异均有统计学意义(P<0.05)；MNC组患儿采集量高于AutoPBSC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患儿采集情况比较

2.2两组患儿采集物比较 AutoPBSC组患儿采集物WBC高于MNC组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组患儿采集物淋巴细胞百分比、采集物淋巴细胞数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组患儿采集物比较

3 讨 论

CART-19 细胞疗法的出现给血液恶性肿瘤患者带来了更多的生存希望，该疗法在急性淋巴细胞白血病等早期临床试验中成效明显[5]。细胞因子CIK细胞是一种效应细胞，从技术和方法学角度看，它们在体外很容易扩张，而且安全，并且对血液系统恶性肿瘤显示出有效性。CIK细胞对广泛的肿瘤组织类型发挥细胞毒性，但对正常组织和造血前体细胞不起作用。成功采集淋巴细胞是培养CART细胞和CIK细胞的关键。CART细胞回输后桥接造血干细胞移植(HSCT)，对于HSCT 患者而言，有效红细胞输注可延长输注红细胞在体内的存活时间，延长患者输注红细胞的时间间隔，降低异体红细胞输血量，避免机体接收过多的外来血型抗原刺激，降低同种异体抗体发生比例[6]。有研究证实，不同剂量的成分输血可改变急性白血病患儿的免疫功能，使患儿产生不同程度的免疫抑制，尤其以大剂量成分输血对患儿的免疫抑制作用影响更为明显[7]。COBE Spectra血细胞分离机操作手册要求，系统的体外环路容量超过患儿TBV的10%～15%时，为维持患儿的血流动力学稳定性，需用一个单位与患儿相容的红细胞冲润体外环路。MNC程序的管路存留的体外环路容量为285 mL，其中所需红细胞量为114 mL，等于TBV的10%时，如果患儿TBV等于或小于2 840 mL时，需实施红细胞预注，等于TBV的15%时，如果条件是患儿TBV等于或小于1 893 mL时，需实施红细胞预注。AutoPBSC程序的管路体外环路容量为165 mL，其中所需红细胞量为66 mL，等于TBV的10%时，如果条件是患儿TBV等于或小于1 650 mL时，需实施红细胞预注，等于TBV的15%时，如果条件是患儿TBV等于或小于1 100 mL时，需实施红细胞预注。患儿体质量轻、血容量较少，对血容量改变的反应较成人更明显，采集前用红细胞预注管路，可避免发生低血容量不良反应[8]。AutoPBSC程序体外循环血量少，故适合于儿童患者。如患者呈贫血状态，管路所需红细胞量占全血红细胞总容量超过15%，不论哪种程序，都需进行红细胞预注，以保证血流的稳定性。对于重度贫血患者，采集前用红细胞预注管路可减少管路占用红细胞带来的不适。

本研究探讨了TBV在1 100～1 893 mL时，选用MNC程序在采集静态淋巴细胞前进行红细胞预注，选用AutoPBSC程序在采集静态淋巴细胞前可不进行红细胞预注，其采集产品中淋巴细胞数无差别，为临床医生提供了参考依据。目前仍处于新型冠状病毒疫情期间，各地血源紧张，AutoPBSC程序和MNC程序收获的采集效果相同，应用AutoPBSC程序采集静态淋巴细胞，节省血源，可减少输血相关感染的风险，减少输血过敏反应及输血带来的不良反应，把紧缺的血留给更需要的患者。儿童采集不同于成人，理想状况下，取患儿的肘前静脉进行穿刺作为采血端，对侧穿刺腕部或肘部作为回输端。然而，幼儿外周静脉常无法实现上述操作。大多数情况下需要建立中心静脉通路，即由医生在深静脉内放置中心静脉导管。股静脉置管采集中，所置管路为双腔，进血管路连接侧孔，收集患者全血，回输管路连接端孔，以避免局部涡流形成的内循环，影响采集效果。如侧孔出血不畅，可将进血管路连接端孔，另选择外周静脉建立回路。在MNC程序中，如遇到输入压力不稳，反复报警情况时，采集界面不稳定，可影响采集效果。MNC程序采集过程中，离心舱收集管断断续续，白膜层收集尾部颜色以略带粉红色为宜，如收集的白膜层尾部颜色很浅，表明MNC收集不够，宜将血浆泵参数调高；如收集的白膜层尾部颜色偏红，则表明产品中混入红细胞过多，宜将血浆泵参数调低。因此，程序参数的调节是一把双刃剑，单位处理血量中主产品得率的提高意味着其他细胞的混入率增加，若提高主产品的纯度则会降低主产品的得率[9]。AutoPBSC程序为全自动程序，对血流速度的要求相对MNC程序低，对采集操作者的要求低，采集界面更稳定。BURGSTALER等[10]尝试用不同的程序及设置以比较主产品的收集情况。AutoPBSC程序在采集时间方面较MNV程序增加，工作人员需监测抗凝剂枸橼酸钠引起的不良反应，采集过程中应用预防性补钙方法，采集过程中对患儿实施心电监测、血氧饱和度监测，采取预防性补钙，采集前口服葡萄糖酸钙溶液20 mL，采集过程中每小时口服葡萄糖酸钙溶液10～20 mL，可减少低钙反应。

总之，对于低体质量患儿，AutoPBSC程序更好，采集效果好，不需红细胞预充，对采集技术要求低。应为患儿提供优质的护理服务，包括采集前、采集中、采集后的护理，做好充分的心理护理和健康宣教，取得患儿的信任和配合，减轻其身体不适，从而保证采集工作顺利开展。