3 632例人乳头瘤病毒筛查情况及基因型分析*

覃羽华，谢丽玲，施桂玲，元辉雄，梁菊华

右江民族医学院附属医院：1.检验科；2.妇产科,广西百色 533000

宫颈癌是女性恶性肿瘤的常见类型，发病率仅次于乳腺癌。世界范围内每年宫颈癌约86%的新发病例发生于发展中国家，我国每年约有10万宫颈癌新发病例，死亡病例约3万。与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒(HPV)根据其致病力大小不同，可分为低危型和高危型，高危型 HPV的持续感染被认为是诱发宫颈癌及癌前病变的必要因素[1]，因此，开展HPV感染的筛查工作意义重大。流行病学调查显示，HPV基因型别分布呈现地域性、种族性和多样性等特点，中国女性感染的基因型以HPV16、18、52、58和59型多见，但各种型别的分布数量和模式在不同地区之间存在差异[2]。本研究对2018年5月至2019年4月在本院就诊女性的HPV感染流行病学特征及23种基因型分布特点进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年5月至2019年4月在本院接受HPV筛查的门诊、住院患者及健康体检者共11 472例作为研究对象，均为女性，年龄17～85岁，中位年龄38.27岁。另收集其中经病理活检诊断患有不同程度宫颈病变的676份宫颈脱落细胞标本进行HPV感染的流行病学调查研究。纳入标准：有性生活史；24 h内无性生活；首次自愿进行HPV筛查。排除标准：接种过HPV疫苗；月经期；72 h内有阴道冲洗或给药史。

1.2仪器与试剂 仪器：美国BIO-RAD公司S1000TMThermal Cycler PCR扩增仪；亚能生物技术(深圳)有限公司YN-H16恒温杂交仪；德国Thermo Fisher Scientific公司Legend Micro 17微量台式高速离心机；上海驰唐电子有限公司XW-80A旋涡混合器；珠海黑马医学仪器有限公司H1干式恒温仪。试剂：HPV基因分型检测试剂盒采用亚能生物技术(深圳)有限公司产品，批号QX201901017，包括17种高危型(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82型)和6种低危型(HPV 6、11、42、43、81和83型)。

1.3标本采集 宫颈脱落细胞标本采集：以无菌窥阴器暴露宫颈，用棉拭子擦去宫颈口过多分泌物，将专用采样宫颈刷置于宫颈口处，顺时针旋转4～5圈，取出宫颈刷标本装于加有细胞保存液的采样管中，沿刷柄折痕处将刷头折断，加盖密闭，贴好患者信息条形码，置4 ℃冰箱保存待检。

1.4方法

1.4.1HPV DNA提取 充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干。把洗脱液全部转移到1.5 mL离心管中，13 000 r/min离心10 min，弃上清液，保留管底的细胞沉淀。加入50 μL裂解液悬浮沉淀，金属浴10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清液待用。

1.4.2PCR扩增 在标记好的PCR管中加入20 μL反应液和5 μL已提取的待测样品DNA(同时设置阴性和阳性质控各1个)，反应总体系为25 μL，3 000 r/min离心5 s后上机进行扩增。扩增条件：50 ℃ 15 min、95 ℃ 10 min、94 ℃ 30 s、42 ℃ 90 s、72 ℃ 30 s，共循环40次，72 ℃ 5 min。

1.4.3杂交 将编好号的膜条和对应的PCR产物放入离心管中，加入相应的试剂后，在沸水浴中加热10 min，然后放入杂交箱51 ℃杂交1.5 h。具体步骤按说明书执行。

1.4.4结果判断 根据膜条上蓝色斑点显现的位置，读取相应的标注信息：膜条上质控IC位点不显现蓝色斑点的为试验不成功，结果无效；只在膜条的IC位点上显现蓝色斑点，其他位点均不显色的为阴性结果；除IC位点外，仅在一个基因型位点显现蓝色斑点的为相应基因型单一感染；除IC位点外，在多个基因型位点显现蓝色斑点的为相应基因型混合感染。

1.5统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行数据分析处理。计数资料以例数或百分率表示，各组间率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同年龄组HPV阳性检出率比较 在11 472例女性参检者中共检出HPV阳性患者3 632例，阳性检出率为31.66%，其中>60～70岁组HPV阳性检出率最高，达35.03%，>50～60岁组HPV阳性检出率最低，为28.60%。各年龄组HPV阳性检出率差异无统计学意义(χ2=10.480，P=0.106)；各年龄组HPV阳性构成比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同年龄组HPV阳性检出率比较

2.2不同年龄组不同HPV基因型别分布情况比较 单纯低危型、单纯高危型及低危型合并高危型3种模式HPV阳性检出率比较，以单纯高危型感染最多，HPV阳性检出率均大于20%，其余两种感染模式阳性检出率均小于10%。单纯低危型HPV阳性检出率较高的是17～20岁组和>60～70岁组，分别为7.95%和7.34%；单纯高危型HPV阳性检出率较高的是>40～50岁组和>60～70岁组，分别为25.91%和25.42%；低危型合并高危型HPV阳性检出率最高的是>40～50岁组，达4.06%。各年龄组3种感染模式HPV阳性检出率差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同年龄组不同HPV基因型别分布情况比较[n(%)]

2.323种HPV基因亚型感染情况比较 3 632例HPV感染者标本中检测到23种HPV基因亚型，共有5 214例病毒株，高危型构成比为81.88%(4 269/5 214)，低危型构成比为18.12%(445/5 214)。所有HPV感染以单一基因型感染为主，共检测出2 517例，占48.27%，双重基因型感染1 605例，占30.78%，多重基因型感染1 092例，占20.94%。其中单一高危型感染最多，共2 130例，占40.85%，其次是双重高危型感染1 285例，占24.65%，单一、双重及多重感染均以HPV52型构成比最高，分别为21.22%、16.51%和13.00%。高危型以HPV52型和HPV16型为主，阳性构成比分别为18.05%和10.78%；低危型以HPV81型和HPV43为主，阳性构成比分别为5.87%和4.22%。HPV45、73、82、83型的阳性构成比均较低，均小于1%。见表3。

表3 5 124例HPV感染者23种基因亚型感染情况比较[n(%)]

2.410种HPV基因亚型在不同宫颈病变患者中的感染情况比较 在3 632例HPV感染者中选取676例宫颈病变患者，共检出HPV高危基因型8种，包括HPV16、18、51、52、53、58、59和68型；低危型两种，包括HPV6型和HPV81型。HPV16型在宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级和CINⅡ级中阳性构成比较高，分别为22.30%和27.27%，其次是HPV52、53及59型；CINⅠ级和CINⅡ级共检出HPV6型和HPV81型感染各3例。CINⅢ级和宫颈癌以HPV16型阳性构成比最高，分别为47.26%和61.11%，其次是HPV18型，分别为24.66%和27.78%，CINⅢ级和宫颈癌均未检测出HPV低危型感染。宫颈癌检出的HPV高危型共有4种，分别是HPV16、18、52、58型。见表4。

表4 10种HPV基因亚型在不同宫颈病变患者中的感染情况比较[n(%)]

3 讨 论

HPV是一种球形双链DNA病毒，属于乳头瘤空泡病毒A属，能引起人体黏膜鳞状上皮的增殖和皮肤上皮细胞的病变。HPV感染是生殖道最常见的病毒性感染，大多数HPV感染短暂且无症状，可以通过宿主免疫系统自发清除，但少数HPV感染会持续较长时间，可在男性和女性中引发一系列疾病，包括癌前病变甚至可能进展为癌症。高危型HPV(16型和18型最为常见)的持续感染已被确定为导致宫颈癌的主要因素，由于HPV持续感染进展为宫颈癌需要数十年的时间，因此，这个长时间的窗口为早期筛查和临床干预提供了黄金时机[3]。

本研究结果显示，在本院门诊、住院就诊及体检的女性HPV阳性检出率为31.66%，低于周莹等[4]对广西地区HPV阳性检出率(36.71%)的研究结果。广西西南边远少数民族地区的农村女性受教育程度低，缺乏相关卫生知识，对HPV感染的重视程度不够，错过早期筛查、诊断和治疗的时机，而且老年人机体内环境改变，免疫功能减退，清除HPV感染的能力减弱，容易造成HPV的持续感染或潜伏的HPV重新激活而引发感染[5]。当老年人出现临床症状就诊时病变已较为严重，结局不良，导致了本研究中HPV阳性检出率以>60～70岁年龄段为最高的结果。本研究结果显示，本地区女性HPV感染以单纯高危型感染为主，单纯高危型HPV阳性检出率最高的年龄段为>40～50岁，与我国女性感染的高峰年龄段一致[6]，但略早于沈洁等[7]报道的北京市女性高危型阳性检出率最高的年龄段。单纯低危型HPV阳性检出率最高的是17～20岁组，本地区处于该年龄段的女性对性知识缺乏正确的认识，农村女性结婚、怀孕过早，容易发生HPV感染。对17～20岁年轻的女性，应积极进行性知识和卫生知识的宣教活动，避免易感因素发生；而对于>40～50岁的女性，应积极进行HPV感染的筛查和病毒载量的检测，预防不良结局发生。世界范围的流行病学调查显示，全球女性 HPV 感染的型别大致包括16、18、31、58 和 52型，但不同地域HPV感染的主要基因型不尽相同[8]。本研究结果显示，本院常见的HPV感染高危基因型别依次为52、16、58、51、53和68型，低危型别依次为81、43、42和6型，与我国大多数地区的流行病学研究报道结果相近[9-12]，同时又具有HPV感染基因型的区域分布特点。本院HPV筛查以单一高危型感染为主，阳性检出率(18.57%)和阳性构成比(40.85%)均低于于秀文等[13]报道的黑龙江西北部地区女性的感染率。本研究中，随着宫颈病变发展程度的不同，HPV感染的主要基因型别也不同。CINⅠ级和CINⅡ级病变以HPV16型和52型感染为主，而CINⅢ级和宫颈癌病变则以HPV16型和18型感染为主，印证了WHO/国际癌症研究机构所明确的全球70%的宫颈癌及癌前病变与HPV16型和18型感染密切相关。有研究表明，HPV16、33、39、52和58型在高危基因型中感染最持久，而机体对HPV45、56和59型的感染清除较快[14]。本研究结果显示，在宫颈癌病变中只存在HPV16、18、52和58型感染，其余基因型均未检出。因此，建议本地区女性接种HPV疫苗时首要选择二价疫苗，有经济条件的可选择九价疫苗进行接种。

不同地区HPV感染均有不同的区域特点，这可能与所处地经济发展和受教育程度、居住地环境、日常生活方式、民族风俗习惯及性行为特征等因素有关，需要收集大样本根据HPV感染流行病学相关危险因素进行进一步分析研究。对HPV感染高发地区的女性积极进行标准化筛查，根据本地区流行病学调查研究结果，合理选择疫苗进行接种，以便早期发现和减少癌前病变，从而降低宫颈癌的发生概率，同时对宫颈癌患者也能做到早诊断、早治疗，延长患者生命，造福当地人民。