维生素D在NOD.H-2h4小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎中的作用研究*

柯文才，毛会军，顾芸霞，朱秀菊

复旦大学附属上海市第五人民医院检验科，上海 200240

维生素D是一种常见的脂溶性维生素，它主要参与钙磷代谢，同时也是一种重要的免疫调节剂，与多种疾病(如糖尿病、高血压、肿瘤、自身免疫性疾病等)有关[1-2]。自身免疫性甲状腺炎(AIT)是一种自身免疫性甲状腺疾病，属于器官特异性自身免疫病范畴，主要表现为外周血甲状腺特异性抗体阳性及甲状腺淋巴细胞浸润，其常见的临床症状是甲状腺功能减退，但其病因却未能完全明确[3-4]。目前，维生素D与自身免疫性甲状腺疾病的研究已成为研究热点之一。本研究建立NOD.H-2h4小鼠实验性AIT动物模型，给予维生素D干预，留取NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织，HE染色后观察其组织形态学变化及淋巴细胞浸润情况。留取NOD.H-2h4小鼠血清采用电化学发光免疫分析法(ECLI)检测甲状腺素(T4)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)水平；采用ELISA检测NOD.H-2h4小鼠血清白细胞介素(IL)-17、IL-23水平。研究维生素D在AIT病情发生和发展中是否发挥作用，为活性维生素D3在AIT的临床治疗中提供科学理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 NOD.H-2h4小鼠在上海医学院实验动物中心SPF实验室内饲养和繁殖(12 h光照/12 h避光)。所有动物的饲养及实验均根据动物实验指南并经过动物伦理委员会批准。选取45只雌性NOD.H-2h4小鼠(4周龄、平均体质量约20 g)随机分为对照组、实验组和维生素D干预组，每组各15只。

1.2仪器与试剂

1.2.1ECLI 仪器为瑞士罗氏公司生产的Cobas e601全自动免疫发光分析仪,试剂为该公司的配套试剂。

1.2.2ELISA 仪器为ELX808吸收光酶标仪(美国伯腾仪器有限公司),试剂为上海威奥生物科技有限公司生产的鼠IL-17和IL-23 ELISA试剂盒。

1.2.3维生素D 选用骨化三醇软胶囊(盖三淳)，由正大制药(青岛)有限公司生产，每粒0．25 μg，性状为淡黄色至黄色的油状液体。

1.2.4组织切片 Leica CM1950冷冻切片机(德国莱卡仪器有限公司)、Leica ST5010全自动染色机(德国莱卡仪器有限公司)和Olympus CX23显微镜(山东科艾瑞生物科技有限公司)。

1.3方法 对照组NOD.H-2h4小鼠同步用无菌双蒸水喂养8周；实验组NOD.H-2h4小鼠使用含0.005%(50 mg/L)碘化钠的无菌双蒸水(大约为100倍正常碘的摄入量)喂养8周，同时每2天按小鼠体质量给予无菌花生油5 μg/kg口服；维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠使用含0.005%(50 mg/L)碘化钠的无菌双蒸水(大约为100倍正常碘的摄入量)喂养8周，同时每2天按小鼠体质量给予5 μg/kg维生素D口服。所有NOD.H-2h4小鼠均在实验8周后经麻醉处死。各组小鼠血液标本抽取后离心，分离血清，-80 ℃保存待测。采用ECLI检测T4、TgAb、TPOAb水平，检测项目均参加中华人民共和国原卫生部和上海市临床检验中心室间质评，实验同时检测低值和高值2个质控，结果均在控；采用ELISA检测血清IL-17、IL-23水平，试验步骤及条件严格按照试剂盒说明书要求执行。NOD.H-2h4小鼠经麻醉处死后取出甲状腺组织，处理成石蜡切片，并进行HE染色，观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分，试验步骤按照相关仪器操作规程执行。

2 结 果

2.13组NOD.H-2h4小鼠AIT发生率及血清甲状腺相关指标水平比较 与对照组比较，实验组和维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠AIT发生率差异均有统计学意义(P<0.05)，但实验组与维生素D干预组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，实验组和维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；血清T4水平在各组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与实验组比较，维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组NOD.H-2h4小鼠AIT发生率及血清甲状腺相关指标水平比较

2.23组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织形态学观察 3组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织经石蜡切片，HE染色后，光镜下对照组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织显示完整结构，甲状腺滤泡形态正常，未见淋巴细胞大量浸润；实验组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织结构破坏明显，甲状腺滤泡形态发生明显改变，见大量淋巴细胞明显浸润；维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织与对照组比较，有组织破坏，但没有实验组破坏严重，甲状腺滤泡的形态改变及淋巴细胞浸润程度都有所减轻,见图1。

图1 光镜下各组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织切片(HE染色，×400)

2.33组NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平比较 与对照组比较，实验组和维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与实验组比较，维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平比较

3 讨 论

AIT是一种临床上常见的甲状腺疾病，属于器官特异性自身免疫病范畴，主要表现为血清甲状腺特异性抗体阳性及甲状腺组织淋巴细胞浸润，其常见的临床症状是甲状腺功能减退，但其病因未完全明确。维生素D是一种常见的脂溶性维生素，多项研究表明，维生素D主要参与钙、磷代谢，降低佝偻病、骨折、骨质疏松症和骨软化症的发病风险，还具有免疫调节功能，可能在多种自身免疫性疾病(包括糖尿病、高血压、肿瘤、自身免疫性疾病等)的发生和发展中起重要作用[5-8]。目前，维生素D与自身免疫性甲状腺疾病的研究已成为研究热点之一，大量研究认为维生素D参与免疫炎性细胞的分化过程，影响细胞因子水平，以及维生素D受体蛋白基因多态性加速免疫细胞凋亡，从而影响AIT病情的发生和发展[9-11]。

国外目前主要应用AIT动物模型进行研究[12]，本研究通过连续8周给4周龄的NOD.H-2h4小鼠喂养一定水平的碘化钠进行小鼠AIT造模，通过小鼠甲状腺组织病理切片和血清甲状腺相关指标检测显示，NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织的结构破坏明显，甲状腺滤泡形态发生明显改变，见大量淋巴细胞明显浸润；实验组NOD.H-2h4小鼠AIT发生率高达93.3%，验证了NOD.H-2h4小鼠是非常理想的研究AIT的易感建模动物。经过同步维生素D预防性干预，虽然维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠AIT发生率并没有明显降低，但是NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织形态破坏及淋巴细胞浸润程度明显降低。与对照组比较，实验组和维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明显升高，维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平较实验组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明，维生素D具有延缓NOD.H-2h4小鼠甲状腺自身免疫反应损伤的作用。有文献报道，1,25(OH)2D3有助于甲状腺组织保持正常形态，维持血清TPOAb、TGAb等抗体及炎症因子正常水平，延缓桥本甲状腺炎的病情进展[13]。

2009年HORIE等[14]报道了Th17细胞在动物模型上诱导AIT发挥作用，其中Th17细胞分泌发挥效应的最主要的细胞因子是IL-17。同时，IL-23在Th17细胞的分化中也发挥重要调节作用，是Th17 细胞存活、增殖的重要细胞因子；IL-17参与AIT的发病过程，介导炎性反应和甲状腺组织的免疫损伤。IL-23和IL-17形成特殊的炎性轴，从而激活JAK/STAT/NF-kB/P13K蛋白通路，促进炎症因子的表达，使其在多种炎性反应和自身免疫性疾病中发挥重要作用。本研究结果显示，实验组NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平与对照组比较，结果均明显升高。有研究发现，在自身免疫性甲状腺疾病患者中血清维生素D缺乏广泛存在，维生素D的缺乏有可能影响疾病的发生和发展[10]；也有研究发现，维生素D可以通过维生素D受体降低Th17细胞的转录，负向调控Th17细胞，降低相关效应细胞因子的分泌[6]。维生素D干预组NOD.H-2h4小鼠通过维生素D干预，较实验组NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平表达明显降低。

总之，维生素D在AIT发病中能减轻甲状腺炎性反应程度，降低血清IL-17、IL-23水平，但具体机制有待进一步深入探讨，最终可能为维生素D3在AIT的临床治疗中提供相关理论依据。