参芪排毒汤对宫颈癌组织人乳头瘤病毒E6/E7、P53和PRb基因蛋白表达的影响

郝志晔，张 晶，钱 伟，卢雯平

(1.中国中医科学院广安门医院肿瘤科，北京 100053；2.深圳市宝安区中医院内分泌科，广东 深圳 518103)

宫颈癌是女性生殖系统中的一种常见的恶性肿瘤，是一种严重危害女性健康及生命安全的恶性病变[1-3]。其发病率位居女性恶性肿瘤第二位，仅次于乳腺癌。目前认为宫颈癌的发生与长期宫颈炎性浸润、内分泌紊乱、不良性生活、遗传等因素相关[4-6]。我国宫颈癌的发生率呈现出上升趋势，且有发病年龄逐渐年轻化走向。我们每年的宫颈癌新发病例约13万左右，每年约有5.3万例患者因宫颈癌死亡[7-8]。虽然早期宫颈癌通过手术治疗多可获得理想预后，但术后复发率、转移率较高，且因本病早期多无典型表现，而导致确诊时已经失去最佳手术时间。随着新辅助化疗技术的发展与应用，更多的宫颈癌患者获得了手术治疗机会。新辅助化疗能够在术前有效缩小病灶体积、抑制肿瘤细胞活性、控制肿瘤细胞过度生长。但新辅助化疗仍具有一定的不良反应，部分患者难以耐受而影响了临床疗效。同时化疗亦可使患者的免疫功能受到一定干扰，对化疗疗效与术后恢复均有不良影响。为此本次采用中药联合应用于新辅助化疗当中，以提高化疗效果。为深入了解参芪排毒汤对宫颈癌组织的作用机制，本院特对宫颈癌组织中的HPV E6/E7、P53、PRb表达水平进行了研究分析，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2014年1月至2017年6月在本院接受治疗的宫颈癌患者中选择112例进入研究，按随机数字表划分成对照组与治疗组。诊断标准：《妇产科学》中的相关标准[9]。临床分期依据国际妇产科联盟(FIGO)标准[10]。病例纳入标准：①经本院医学影像学、病理学检查后符合上文诊断标准确诊为宫颈癌的患者；②FIGO标准属于Ⅰb～Ⅱa期；③此前无放化疗史，本院首诊者；④患方自愿参与，且签署知情同意书。本项研究经本院伦理委员会批准。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②不符合前文中的诊断、分期标准；③经评估无法耐受新辅助化疗；④有腹腔镜手术禁忌证；⑤无法配合术后复发及随访。对照组56例患者年龄为34～62岁，平均(46.81±6.37)岁；病灶最大直径为2.6～6.7 cm，平均(4.47±0.35)cm；病理分型：腺癌4例，鳞癌52例；临床分期：Ⅰb期26例，Ⅱa 期30例。治疗组56例患者年龄为33～65岁，平均(47.12±6.54)岁；病灶最大直径为2.7～6.9 cm，平均(4.51±0.37)cm；病理分型：腺癌3例，鳞癌53例；临床分期：Ⅰb期24例，Ⅱa 期32例。统计学分析两组以上资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 治疗方法

1.2.1 对照组：两组均于术前行新辅助化疗，首次化疗前行紫杉醇静脉药敏实验，化疗前1 d及紫杉醇首次用药前30 min，行地塞米松脱敏；给予体征监护。化疗周期第1天，给予紫杉醇注射液(国药准字H20053001)135～175 mg/m2，加入至0.9%氯化钠注射液(国药准字H20043271)中，静脉滴注3 h；休息1 h后，给予顺铂注射液(国药准字H20040812)70 mg/m2中，静脉滴注。化疗后休息21 d为1个化疗周期，共治疗2个化疗周期。新辅助化疗后行腹腔镜宫颈癌根治术。

1.2.2 治疗组：在对照组上述治疗的同时于第1个化疗周期第1 d起开始服用参芪排毒汤，方剂组成：生黄芪30 g，川牛膝、白花蛇舌草各24 g，昆布15 g，赤芍12 g，生晒参、苍术、黄柏、牡丹皮、地龙、炙甘草各10 g。加减：下腹疼痛加白芍30 g，威灵仙12 g，没药6 g；少腹寒凉加肉桂10 g，吴茱萸6 g；食欲不振加鸡内金15 g，陈皮10 g；带下气味大、量多有血加炒薏米、芦根各30 g，侧柏炭15 g；便秘加火麻仁12 g，生大黄10 g。诸药以水煎法煎制两次，共取汁约480 ml，分别于每日早晚温热后口服，每日1剂，连续服用至新辅助化疗完成。

1.3 测定方法

1.3.1 HPV E6/E7 mRNA表达测定方法：术中留取病理组织，使用默瑞(上海)生物科技有限公司生产的HPV E6/ E7 mRNA检测试剂盒，检测原理为支链DNA杂交技术，能够检出HPV16、18、31、33、35、39、45、 51、52、56、58、59、66和68，共计14种高危型HPV的E6/E7 mRNA。实验步骤严格遵照说明书进行。

1.3.2 P53、PRb蛋白表达测定方法：术中留取病理组织，采用免疫蛋白印迹(WB)实验测定P53、PRb蛋白表达。主要步骤：采用北京索莱宝公司生产的全蛋白提取试剂盒提取组织总蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度，配置为1 μg/μl的蛋白溶液。以10 μl为电泳浓度进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，先行预电泳1 h，再行蛋白电泳 80 min，电泳后采用电转印装置将凝胶上的蛋白转移到NC膜，以便于抗体孵育。孵育前5%的脱脂牛奶封闭非特异性蛋白的结合位点，加入一抗，4 ℃孵育过夜，一抗孵育后二抗孵育，37 ℃孵育90 min，ECL试剂荧光显像，暗室胶片显影。采用Image J软件分析显影灰度，P53蛋白表达量= P53灰度/内参灰度，PRb蛋白表达量= PRb灰度/内参灰度，内参为GAPDH。

1.3.3 预后评估方法：术后随访时间最少3年，术后2年内每3个月到院复查1次，术后3～5年每6个月到院复查1次，于复查时记录患者有无复发、转移、及死亡，绘制生存曲线和无进展生存曲线，以分析患者预后。

1.4 疗效标准 疗效评估方法：术前1 d，依据世界卫生组织制定的实体瘤疗效评价标准评估[11]。病灶完全消失且维持1个月及以上为完全缓解；病灶体积缩小50%及以上且维持1个月及以上为部分缓解；病灶体积缩小不足50%，或有增大但未达25%维持1个月及以上为稳定；病灶体积增大达25%及以上为进展，缓解包括完全缓解与部分缓解。

1.5 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行分析。等级资料以秩和检验，计数资料以[例(%)]表示，采用卡方检验；计量资料以均数±标准差表示，用t检验；生存时间以Kaplan-Meier分析，绘制生存曲线图，比较以Log-Rank检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组临床疗效比较 见表1。治疗组缓解率为83.93%，对照组为62.50%，治疗组缓解率高于对照组(χ2=6.556，P<0.05)，治疗组临床疗效优于对照组(Z=-2.273，P<0.05)。

表1 两组临床疗效比较[例(%)]

2.2 两组不良反应发生比较 见表2。治疗组不良反应发生率为12.50%，对照组为17.86%，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 两组不良反应发生比较[例(%)]

2.3 两组组织样本中HPV E6/E7 mRNA、P53、PRb表达水平比较 见表3。化疗后两组患者癌旁组织中HPV E6/E7比值经分析，差异无统计学意义(P>0.05)，病理组织中HPV E6/E7表达高于治疗组(P<0.05)，两组癌旁与病理组织中P53、PRb比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表3 两组组织样本中HPV E6/E7 mRNA、P53、PRb表达水平比较

2.4 两组患者生存函数分析 见表4。对照组随访时间为25.87～71.52个月，治疗组为30.29～71.53个月；治疗组患者PFS、OS均长于对照组(均P<0.05)。

表4 两组患者生存函数分析(月)

3 讨 论

新辅助化疗是一种术前应用的化疗方式，也称早期化疗、先期化疗。其主要目的在于降低肿瘤细胞的活性、缩小肿瘤病灶的体积，扩大手术治疗的适应范围[12-13]。宫颈癌由于早期多无典型表现，而使部分患者错失最佳手术时机，通过新辅助化疗能够使其获得手术治疗的机会，对于延长患者生存时间、提高预后生存质量具有重要意义[14-15]。新辅助化疗多于瘤体的血管床未被破坏时开始，可使化疗药物发挥最佳疗效并可降低脉管浸润风险，辅助提高手术疗效。新辅助化疗在减少术后复发、转移方面具有明确功效。宫颈癌的手术治疗属于有创性治疗，且创伤范围较大，因此术后患者的免疫功能有所降低，在机体恢复时期易给肿瘤造成复发机会，因此在术前进行化疗不仅可增加手术机会、降低手术难度，同时还因患者机体尚未受到创伤、免疫功能相对较理想而使化疗效果得到更好的保障，提升患者对化疗的耐受度。宫颈癌患者在疾病作用下多出现诸多不适与免疫功能紊乱，因此新辅助化疗仍面临部分患者耐受度低的问题。为了进一步提高新辅助化疗的效果，临床上关于中西医联合的研究逐渐增多，中医学在宫颈癌治疗方面具有丰富经验与独特优势。中医治疗通过辨证施治，在整体改善患者健康基础，增强患者术前免疫功能方面疗效确切。

中医理论认为宫颈癌属于“癥瘕、阴疮、积聚”等范畴，认为本次属于正虚邪实之症[16-17]。化疗形成的不适在中医理论认为属外邪入体。因此治疗应以清毒逐瘀、去腐生新、补气和中为要。本院参芪排毒汤中，生晒参属补气类中药，性平、味甘、微苦，归心、脾、肺经，有复脉固脱、大补元气、补益脾肺、止渴生津、安神益智功效，主治阳虚宫冷、肢冷脉微、体虚欲脱、津伤口渴、久病虚羸等病症。生黄芪为补气圣药，其味甘、性微温，入肺、脾经，有益卫固表、托毒生肌、补气升阳、利水消肿功效；黄芪擅长于治疗食少便溏、气虚乏力、中气下陷、脏器下垂、气虚水肿、阴疽漫肿等病症。苍术性温、味辛、苦，归脾经，苍术有燥湿健脾，散寒祛风功效，苍术、黄柏、川牛膝三味药为三妙丸，治疗湿热下注引起的妇科带下、盆腔炎、宫颈疾病有较好的疗效。牡丹皮味苦、辛，性微寒，归心、肝、肾、心经，具有凉血、活血、清热化瘀功效；主治温毒血热吐衄，阴虚发热、无汗骨蒸，痈肿疮毒等症。丹皮苦寒善清营血实热，其辛开苦泄，方具有活血祛瘀之功。赤芍性微寒、味苦，归肝经。赤芍有清热祛瘀、凉血止痛功效。白花蛇舌草味苦、甘，性寒，归心、肝、脾、大肠经，有清热解毒、消痈利湿作用，主治咽喉肿痛、肺热咳喘、疖肿疮疡、肠痈、癌肿等症。地龙性寒、味咸，归肝、脾经、膀胱经，有清热熄风、通络平喘、利水消肿功效；现代药理研究显示地龙可以调节机体免疫功能、有抗肿瘤、溶解血栓作用。昆布味咸、性寒，入肝、肾经，具有软坚消痰，利水消肿功效，主治瘰疬、瘿瘤，睾丸肿痛，水肿、痰饮水肿；现代药理研究昆布对存在于体外的人体癌细胞和肿瘤有显著的抑制作用，能提高人体的体液免疫，促进细胞免疫。炙甘草可补气和中、健脾养胃、调和诸药。

本次研究结果表明，在新辅助化疗的同时应用参芪排毒汤能够提高化疗功效。P53为肿瘤抑制基因之一，能够抑制肿瘤增殖。HPV E6/E7>1为阳性标准，是宫颈癌形成的一项独立危险因素[18]。宫颈癌细胞内的HPVE6基因能够主动整合至细胞基因组当中，使HPVE6癌蛋白与P53发生结合，形成硫醇酯复合物而促进泛素活化，致使P53被蛋白酶降解，从而使P53在宫颈癌细胞中的含量异常下降，削弱了P53的抑癌能力。PRb是一种肿瘤抑制蛋白，HPV E7基因编码类的蛋白能够主动结合PRb，导致其磷酸化失活，释放核转录因子E2F，从而促使感染实现基因转录、恶性增殖。因此PRb在宫颈癌细胞中可见低于正常组织的过低表达。本次研究结果表明，经治疗治疗组患者的宫颈癌组织HPV E6/E7、P53、PRb表达水平均优于对照组；提示参芪排毒汤具有改善宫颈癌组织中HPV E6/E7、P53、PRb表达水平的作用，这可能是参芪排毒汤在辅助宫颈癌化疗中发挥良好作用的一项重要机制。经3年随访得知，治疗组患者PFS、OS均长于对照组；提示参芪排毒汤的联合应用发挥了降低复发、转移等病情进展的风险，因此可有效延长患者生存时间。经ROC分析可知，在参芪排毒汤联合新辅助化疗完成后，宫颈癌组织中的HPV E6/E7、P53、PRb表达水平对于患者预后病情进展及预后生存时间具有较高预测价值。当患者宫颈癌组织中的HPV E6/E7≥0.895、PRb≥0.455、P53≥0.515时均可提示预后3年内发生病情进展，当HPV E6/E7≥0.925、PRb≥0.435、P53≥0.485时则可提示患者预后3年死亡。因此术中留存病理样本进行HPV E6/E7、P53、PRb检测，可为宫颈癌预后评估提供重要参考。

综上所述，参芪排毒汤能够提高新辅助化疗的临床疗效，为后续手术治疗提供更好的保障。参芪排毒汤能够有效改善宫颈癌组织中HPV E6/E7、P53、PRb的表达水平，鉴于这三项指标对于预测患者预后具有重要的参考价值，可推断联合应用于参芪排毒汤能够辅助宫颈癌患者获得理想预后。