胶质瘤中环状RNA has-circ-0037251水平检测及临床意义

徐泽彪,胡珍渊,方永军,王首杰

(1.陕西中医药大学附属医院神经外科,陕西 咸阳712000；2.空军军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安710038)

胶质瘤具有复发率高、生存率低、侵袭性强的特点，是高度恶性的颅内肿瘤，多数患者治疗效果不佳，严重威胁着人们的健康[1]。因其与正常脑组织无明显界限，且呈指状向脑组织外破坏脑组织，常规切除术疗效不佳，且高度恶性的胶质瘤对放化疗敏感性差，因此寻找新的治疗靶点成为当前的研究热点[2-3]。最近的研究表明，环状RNA在神经组织中含量更加丰富，其在神经元的发育、增殖、肿瘤及其他疾病发生中扮演着重要的角色[4-5]。如在缺血性脑卒中模型中circDLGAP4作为miR-143的海绵，其表达水平的降低能抑制miR-143的功能，增加circDLGAP4的表达量可减轻脑损伤[6-8]；circZNF292通过调控细胞间Wnt信号，影响细胞的增殖，进而参与影响肿瘤组织的血管生成[9-10]；has-circ-0037251是由METRN基因的多个外显子组成的环状RNA，在胶质瘤细胞的增殖和分化中发挥重要的调节作用。此外，研究表明has-circ-0037251通过发挥miR-1229-3p海绵和调节mTOR的表达作用促进胶质瘤的进展，而敲除has-circ-0037251基因则能促进胶质瘤细胞凋亡，并诱导G1期阻滞[11]。目前，对于has-circ-0037251在不同级别胶质瘤中的表达水平还缺乏分析,尤其针对其在临床诊治中的意义还未得到充分研究。因此本研究结合临床随访数据,主要探讨has-circ-0037251在胶质瘤患者中的表达水平及与患者预后、临床病理特征的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2011年7月至2014年12月于空军军医大学唐都医院神经外科行胶质瘤切除术的患者56例为胶质瘤组，其中男24例，女32例，中位年龄为51岁，以上肿瘤组织标本中WHO Ⅰ级20例，WHO Ⅱ级15例，WHO Ⅲ级8例，WHO Ⅳ级13例。标本来源于医院日常收集的胶质瘤组织，患者的临床病理数据是先前对患者的定期随访收集获得。对照组脑组织取自脑出血或外伤需要接受开颅手术的患者，共30例，其中男15例，女15例，中位年龄为40岁。组织标本取出后即在液氮中冷冻，后转入-80 ℃冰箱内。患者病例资料完整，术前均未进行放疗、化疗、手术，并且未进行靶向治疗等其他新型治疗手段。本研究经医院伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》，研究对象或家属均签署了知情同意书。

1.2 检测方法 将冻存的组织从-80 ℃冰箱取出，首先脱蜡处理脑组织标本，随后加入TRIzol试剂从组织标本中提取RNA。采用紫外分光光度计测量RNA浓度，OD260/280在1.8～2.0之间为合格。使用RNA反转录试剂盒按照说明书操作，将提取的RNA逆转录为cDNA后进行荧光定量PCR 技术(qRT-PCR)反应，将GAPDH设为内参，其引物序列为上游5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，下游5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’;人has-circ-0037251引物序列为：上游5’-CTGCTTTGGAGGTGATGGGGAC-3’,下游5’- GGGAGTCGGGGCTCTCAC -3’。采用2-△△Ct法计算has-circ-0037251的相对表达量。所有实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0统计学软件进行绘图和统计学分析。两组间患者临床病理指标的比较采用卡方检验；生存率分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并进行Log-Rank检验；采用单因素和多因素Cox回归分析法评价影响患者预后的临床因素，主要包括年龄、性别、KPS评分、WHO分级、肿瘤大小、肿瘤分化程度，评估has-circ-0037251表达量对患者预后差异的影响。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胶质瘤组织中has-circ-0037251的表达水平 qRT-PCR结果表明：与对照组相比，胶质瘤组中的has-circ-0037251存在过表达现象[对照组(1.000±0.1756)与胶质瘤组织(3.913±0.2589),P<0.05]，且has-circ-0037251表达量与WHO分级呈正相关[WHO Ⅰ-Ⅱ级(2.429±0.1987)与WHO Ⅲ-Ⅳ级(4.628±0.3050)，P<0.05]，高水平表达has-circ-0037251的胶质瘤具有更高的WHO分级。见图1。

注：与对照组比较，*P<0.05;与Ⅰ-Ⅱ级比较，△P<0.05

2.2 has-circ-0037251在胶质瘤组织中的表达与临床病理特征的关系 计算胶质瘤患者has-circ-0037251表达水平的平均值，以此将胶质瘤患者分为has-circ-0037251高表达组(24例)和低表达组(32例)。通过对患者临床病理特征的比较，发现has-circ-0037251的表达水平与WHO分级和KPS评分有关系(均P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小等无关(均P>0.05)。见表1。

表1 has-circ-0037251表达水平与胶质瘤患者临床病理特征的关系(例)

2.3 生存分析 随访期间，记录患者生存情况。然后根据Kaplan-Meier法分析has-circ-0037251表达水平与患者预后的关系，发现has-circ-0037251低表达的患者生存时间更长，且差异具有统计学意义(P=0.0396)。因此，has-circ-0037251的表达量可作为判断胶质瘤患者预后的生物学标志。见图2。

图2 高has-circ-00372517表达组和低has-circ-0037251表达组生存率比较

2.4 胶质瘤患者预后单因素和多因素分析 采用比例风险回归模型进行单因素和多因素分析，结果表明：WHO分级、KPS评分、has-circ-0037251表达水平与患者总生存率相关，且高WHO分级、KPS评分<80、has-circ-0037251的高表达量是影响患者预后的独立危险因素。见表2。

表2 患者临床病理特征和has-circ-0037251表达的单因素和多因素分析表

3 讨 论

胶质瘤是中枢神经系统原发的高度恶性的肿瘤，其增殖、侵袭、转移能力强，造成患者预后不良，术后极易复发[12-13]。近年来对胶质瘤的研究不断深入，但关于其基因调控、发生发展、增殖、侵袭、转移等复杂的分子机制尚未完全阐明，如何改善患者预后，寻求理想的特异性肿瘤标志物对胶质瘤的诊疗有重要意义。

越来越多的的研究表明环状RNA与神经系统的肿瘤的发生有密切联系，诸多文献报道环状RNA参与了胶质瘤的发生和恶性发展过程[14]。circ-0001730参与激活wnt/β-catenin通路，促进胶质母细胞瘤的增殖，侵袭和迁移[15]。Li等[16]发现在胶质瘤中has-circ-0007534通过发挥miR-761海绵的作用，调节ZIC5基因的表达，提示has-circ-0007534/miR-761/ZIC5调控环有望成为新的治疗靶点。此外,表皮生长因子受体(EGFR)来源的has-circ-0080229可通过结合ANXA2等RNA结合蛋白，促进胶质瘤的侵袭和转移[17]。然而到目前为止，有关胶质瘤与环状RNA的研究还不足以应用于临床，此领域有待我们进行更深层次的探索。

本研究选取了与胶质瘤相关的一种环状RNA——has-circ-0037251，探究其在胶质瘤的诊疗、预后判断方面的作用。研究发现，与正常脑组织相比，胶质瘤患者的has-circ-0037251表达水平显著上调，在探究has-circ-0037251表达水平与患者临床病理指标相关性时发现，WHO分期、KPS评分与has-circ-0037251的表达显著相关，这提示has-circ-0037251可能与胶质瘤的生长、侵袭和转移有关，抑制has-circ-0037251表达有逆转胶质瘤的进展的可能，这一点在小鼠体内已得到证实。Cao等[11]研究发现敲除has-circ-0037251可使肿瘤体积变小、重量减轻，延长小鼠生存期。然而，更有效、更准确、更特异的RNA干扰方法，尤其是能安全作用于人体的方案仍有待探索和研究。Kaplan-Meier法生存率分析表明，has-circ-0037251高表达组的生存时间低于低表达组，最后对患者的预后分析显示WHO分级、KPS评分、has-circ-0037251表达水平是影响患者生存率的主要因素，而高WHO分级、KPS评分<80、has-circ-0037251高表达可作为胶质瘤患者的预后独立因素。本研究结果为胶质瘤早期诊断、治疗和及早干预提供了参考依据。

综上所述，has-circ-0037251很有希望作为胶质瘤诊断和预后的生物学标志物，另外，has-circ-0037251能否在其他病理过程中起作用，能否寻找到一种有效干预RNA的手段以及has-circ-0037251能否人体内作为治疗靶点都有待于进一步的深入研究。