生大黄对脑出血大鼠磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶信号通路的影响及其神经保护机制

谢作常，田少斌

脑出血是一种自发性的急性脑实质出血，可导致严重的残疾[1]。据报道，超过三分之一的脑出血病人在出现症状后1个月死亡，20%的幸存者可在6个月后独立生活，部分可致永久残疾[2-3]。脑出血的病理生理机制十分复杂，早期血肿生长和以炎症为主的血肿周围损伤被认为是其最重要的机制。此外，通过靶向转录因子、细胞因子、酶、小胶质细胞活化或氧化应激以降低炎症反应和细胞死亡也被证实与脑出血的发病机制有关[4-5]。有研究表明，生大黄溶液对预防高危病人内镜逆行胰胆管造影后胰腺炎和高淀粉酶血症是安全有效的，并且未发现副作用[6]。有研究发现，生地大黄汤对脑出血大鼠有确切的神经保护作用，能降低神经功能缺损评分[7]。另一项研究表明，生地大黄汤能改善脑出血大鼠脑组织炎性损伤，减少细胞凋亡数[8]。但是，具体机制有待进一步探究。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)信号通路在多种细胞过程如细胞存活和增殖过程中被激活[9]，这一信号通路涉及神经紊乱的减少和神经元细胞的存活[9-10]。渥漫青霉素(Wortmannin，WORT)是其相对特异性抑制剂，替普瑞酮(GGA)通过药物作用于实验性脑出血大鼠模型中的PI3K/Akt信号通路，发挥部分神经保护作用[11]。因此，本研究推测生大黄通过药物作用于PI3K/Akt信号通路，从而发挥神经保护作用，并对此进行验证。

1 材料与方法

1.1 动物及药物 180只SPF级雄性SD大鼠，体质量220～240 g，饲养条件：室温24.5～25.0 ℃，光照黑暗周期为12 h/12 h交替，自由进食饮水。生大黄50 g，采用100 mL沸水浸泡10 min。

1.2 动物分组 180只大鼠随机分为9组：对照组、假手术组(给予相同剂量的生理盐水对照)、脑出血组、脑出血加200 mg/kg生大黄汤组、脑出血加400 mg/kg生大黄汤组、脑出血加800 mg/kg生大黄汤组、脑出血+WORT组、脑出血+生大黄汤+WORT组和对照+800 mg/kg生大黄汤组，每组20只。

1.3 造模方法 参照文献[12]方法建立实验性脑出血大鼠模型。腹腔注射盐酸西拉嗪(4 mg/kg)及氯胺酮(30 mg/kg)，将大鼠放置在一个立体定位仪，颅骨打孔。通过离体定位仪向纹状体注射Ⅶ型胶原酶，超过5 min制造脑出血模型，用骨蜡封住开颅。

1.4 动物给药 对照组：不经任何处理。对照+800 mg/kg生大黄汤组：灌胃生大黄汤800 mg/kg。脑出血组：按脑出血造模方法造模。假手术组：按脑出血造模方法，但注射Ⅶ型胶原酶时给予相同剂量的生理盐水。脑出血加200 mg/kg生大黄汤组、脑出血加400 mg/kg生大黄汤组、脑出血加800 mg/kg生大黄汤组：生大黄汤灌胃，剂量分别为200 mg/kg、400 mg/kg和800 mg /kg，48 h后，按脑出血造模方法造模。脑出血+WORT组：将PI3K的特异性抑制剂WORT(Sigma，美国，16 mg/kg)通过5 μL微量注射器注入大鼠侧脑室，48 h后，按脑出血造模方法造模。脑出血+生大黄汤+WORT组：将PI3K的特异性抑制剂WORT(Sigma，美国，16 mg/kg)通过5 μL微量注射器注入大鼠侧脑室，30 min后灌胃生大黄800 mg /kg，48 h后按脑出血造模方法造模。

1.5 神经功能缺损评估 术后6 h、24 h、48 h、72 h、7 d用Garcia评分量表检测神经功能缺损情况。包括对称性、四肢运动的自发活动、前爪伸展、身体本体感觉、攀爬和对振动的反应[13]。每项测试计0～3分，研究中6项测试共计18分。由一名对干预方法不知情观察者进行行为评估。

1.6 大脑含水量测量 术后6 h、24 h、48 h、72 h、7 d麻醉处死大鼠，采用斩首法测定脑含水量[1]。大鼠大脑移除后用电子分析天平称重，得到湿重，干燥后得到干重。

1.7 血肿体积评估 用5%异氟醚深度麻醉大鼠后，用30 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行心脏灌注处理。左半球、右半球切除分离后，将大脑放入含有3 mL PBS的玻璃管中。血肿体积用光度法测定[14-15]。

1.8 免疫印迹分析 取大鼠大脑，在10% SDS-PAGE凝胶上分离蛋白，转移到PVDF膜上，封闭液封闭后分别用一抗Akt(1∶1 000，Santa Cruz)和一抗p-AKT(1∶1 000，Santa Cruz)4 ℃孵育过夜，以抗β-actin(Santa Cruz)作为对照。在室温下，用与HRP偶联的二抗在TBST中处理1 h。最后使用电化学发光成像分析系统显影，用ImageLab 6.0.0软件分析各目的蛋白条带的灰度值。以目的蛋白条带与内参照β-actin蛋白条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1 大鼠脑出血模型建立 10%水合氯醛麻醉后，双次注射自体血建立脑出血模型(15 μL)进入大脑实质(基底神经节)[16]。脑出血组大鼠造模后神经功能缺损评分明显增加，且症状在48 h最明显。详见图1、图2。

图1 大鼠脑出血模型建立图示(A为造模时Ⅶ型胶原酶的注射位置；B为假手术组造模后冠状切面；C为脑出血组造模后冠状切面)

与假手术组比较，＊ P<0.05。图2 各组大鼠神经功能缺损评分比较

2.2 生大黄干预对大鼠神经功能缺损评分的影响 术后6 h、24 h、48 h、72 h、7 d采用Garcia评分量表检查神经功能缺损情况。脑出血大鼠神经功能缺损明显增加，术后48 h神经功能严重程度评分最低，提示脑出血大鼠模型诱导成功。生大黄预处理显著降低了脑出血大鼠的神经功能缺损，且呈剂量依赖性，表明了生大黄对脑出血大鼠有神经保护作用。由于神经系统严重程度评分最高的是800 mg/kg，因此，本研究随后选择该剂量进行实验。详见图3。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与脑出血组比较，# P<0.05。图3 各组大鼠造模后不同时间点神经功能缺损评分比较

2.3 生大黄及WORT干预对Akt表达水平的影响 为探究生大黄改善脑出血后神经功能受损的具体机制，用PI3K抑制剂WORT进行处理。与假手术组大鼠相比，脑出血模型大鼠Akt表达水平降低，生大黄预处理可明显升高脑出血大鼠Akt表达水平，且差异有统计学意义。相反，与脑出血组相比，WORT处理(脑出血+WORT)降低Akt的表达水平。此外，生大黄汤+WORT处理可以降低生大黄诱导的脑出血大鼠Akt表达水平。详见图4。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与脑出血组比较，# P<0.05；与脑出血+800 mg/kg生大黄汤组比较，△ P<0.05。图4 生大黄及WORT干预对Akt水平的影响(A为免疫印迹图；B为Akt相对表达量)

2.4 WORT及生大黄对脑出血大鼠神经功能的影响 生大黄预处理降低了脑出血大鼠神经功能缺损。与脑出血组相比，脑出血+WORT增加了神经功能障碍，虽然生大黄发挥神经保护作用，且作用呈剂量依赖性，WORT处理(脑出血+生大黄+WORT)减弱了这种保护作用，与脑出血+WORT组相比，神经系统缺损评分升高。详见图5。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与脑出血组比较，# P<0.05；与脑出血+800 mg/kg生大黄汤组比较，△ P<0.05。 图5 WORT及生大黄干预对大鼠神经功能缺损评分的影响

2.5 WORT逆转生大黄对脑出血大鼠脑水肿和血肿体积的影响 对大鼠脑半球含水量及血肿程度进行评定，探讨生大黄对脑出血所致脑水肿和血肿体积的影响。与假手术组相比，脑出血组大鼠脑含水量明显增加，脑出血大鼠脑含水量的增加可能反映出产前发育异常或羊水减少。但是，与脑出血组相比，在诱导脑出血之前应用生大黄明显降低了脑含水量，WORT逆转了生大黄对于脑水肿的影响，与生大黄组相比，WORT组脑水肿程度增加。详见图6。脑出血组的血肿体积增加，在诱导脑出血之前给予生大黄预处理减少了大鼠脑血肿体积，但是这一作用被WORT逆转。详见图7。

与假手术组造模后同时间比较，＊ P<0.05；与脑出血组比较，# P<0.05；与脑出血+800 mg/kg生大黄汤组比较，△ P<0.05。图6 WORT逆转生大黄对脑出血大鼠脑水肿的影响

与假手术组比较，＊ P<0.05；与脑出血组比较，# P<0.05。图7 WORT逆转生大黄对脑出血大鼠脑血肿体积的影响

3 讨 论

2016年，许梅等[7]发现生地大黄汤对脑出血大鼠有神经保护作用[8]，可以降低神经功能缺损、改善脑水肿以及增加神经细胞功能活性。2017年又发现HMGB1 /TLR4 /MMP-9信号通路参与生地大黄汤对脑出血大鼠神经损伤的保护作用，活化的巨噬细胞和单核细胞分泌HMGB1作为炎症的细胞因子介质，TLR4的激活导致了细胞内信号通路核转录因子-κB(NF-κB)和炎性细胞因子的产生，这与体内先天免疫系统的激活有关[17-18]。

PI3K/Akt信号通路在脑发育中起着重要作用。研究发现它是许多大脑过度生长障碍的原因，然而，PI3K/Akt信号通路不仅在病理状态下起作用，正常状态下也起到保护大脑发育的作用。颅内体积也与Akt3内含子变异有关[19]。因此，本研究观察生大黄是否通过PI3K/Akt信号通路发挥神经保护的作用。

本研究发现生大黄预处理可以明显减少脑出血大鼠的神经损伤，生大黄不仅改善神经损伤，也能改善脑出血大鼠的脑水肿和减小血肿体积。这些作用都能被PI3K的抑制剂WORT阻断，说明PI3K/Akt通路参与生大黄对脑出血大鼠的神经保护作用。缺血预处理通过诱导缺血耐受来保护大脑，缺血耐受是由一种亚致死的缺血损伤伴随PI3K/Akt通路激活引起的[20]。PI3K/Akt信号通路是细胞生存、代谢和生长相关转导通路的枢纽[21]。在本研究中，WORT降低了生大黄导致的Akt表达增多。Akt在Ser-196位点磷酸化Caspase-9，在体外阻断细胞色素C介导的Caspase- 9活化[22]。Akt也可能通过叉头框转录因子抑制bax依赖的凋亡通路，从而抑制细胞凋亡[23]。

生大黄在实验性脑缺血大鼠模型中通过PI3K/Akt通路发挥神经保护作用，p-Akt基因可能被认为是脑出血干扰的一个重要因素，但是p-Akt是如何被生大黄诱导的以及是如发挥作用的，还有待进一步研究。