草-溞生物组合修复农田周边富营养化水体氮、磷研究

张春雪，王晗阳 ，2，魏孝承 ，郑向群 ，杨 波

（1.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；2.天津城建大学，天津 300384）

人类的生产和生活加速了氮、磷等营养盐向水环境的排放，造成藻类、浮游生物数量的快速增加，使水体的透明度、溶解氧等大幅度下降。一些藻类代谢产物使得水质迅速恶化，进而造成鱼类、大型水生植物等生物大量死亡，最终导致水环境生态平衡被严重破坏［1-3］，尤其是池塘等封闭水体，由于水体长时间处于停滞状态，缺少交换过程，因而其自净能力较弱，一旦受到外源氮、磷的输入，就会加重其富营养化情况［4］。池塘富营养化会导致藻类生长过剩，从而造成藻类水华，对其他水生生物包括对大型水生植物和水生动物的生长、繁殖能力等产生抑制作用［5］，最终引起水生生物的大量死亡［6］。

据2018年度《中国水资源公报》［3］显示，目前中国大多数水体环境面临着严重的富营养化问题。在所调研的121个湖泊和1 097个水库中，有73.5%的湖泊和30.4%的水库目前都处于不同程度的富营养化状态。富营养化导致水华现象频发，近年来太湖、巢湖、滇池［4］以及天津市的于桥水库［5］均发生过不同程度的蓝藻水华。蓝藻水华会引起水生态系统结构和功能退化，致使中国水质性缺水日益严重，危害人体健康和生态安全，且对当地经济造成巨大的损失［6］。因此，对蓝藻水华的抑制和富营养化水体的修复展开研究具有重要的现实意义。

关于水体富营养化和水华的治理方法通常分为外源控制法和内源控制法两大类［7］。外源控制法主要指通过控制农业面源污染，减少工业废水的排放等［8］，从水体外源减少氮、磷等营养盐的输入，从而实现控制水体富营养化的方法。但由于中国农业面源污染来源分散、复杂，溯源困难，并且不同于点源污染，其排放通常具有随机性［9］，因而对其管理和控制产生难度。此外，一些水体流域的污水管网建设落后，导致外源控制的效果不稳定。内源控制指通过各类措施从水体内部着手，降低水体中氮、磷等营养盐的浓度，从而抑制浮游植物过量生长［10］。目前常见的内源控制方法有物理法、化学法以及生物法。生物法的原理是通过生物之间的补食作用及种间竞争等方式达到抑制藻类生长、恢复水生生态系统稳定性、提高水体自净能力的方法［11］。目前常见的生物法主要包括微生物修复法、生物操纵法、水生植物修复法以及联合生物修复法。生物修复作为一种新兴的环境修复方法，与传统物理化学法相比，具有低成本、环境友好、二次污染小等优点。生物修复已成为当前环境修复的研究热点，近年来被广泛应用于土壤、地表水及地下水等环境的污染治理中。

近年来，一些学者开始考虑将生物操纵与水生植物这2种理论联合，研究其对水华抑制和富营养化水体的修复作用，在生态修复实践中，采用2种或2种以上水生生物联合修复富营养化水体的技术受到广泛关注。李萍等［12］以背角无齿蚌（Anodonta woodiana，俗称河蚌）和苦草（Vallisneria natans）为研究对象，构建中型生态系统，采用二者单一及联合修复富营养化湖泊水体，表明两者的协同作用可以明显降低水体叶绿素及营养盐浓度，此外还发现背角无齿蚌可以促进苦草的生长，试验结束时二者共存的系统中苦草的株高比单培养时增高24.9%。郭颖［13］分别采用滤食性底栖动物河蚌、田螺与沉水植物菹草（Potamogeton crispus）构建复合表面流人工湿地，发现其对氮、磷等营养盐去除效果显著，尤其是河蚌-菹草系统表现出了更好的污染物去除效果，对总氮（TN）、总磷（TP）的去除效果分别达82.80%和98.54%，显著高于其他系统，但河蚌在滤水过程中会产生“假粪”，其中包含大量氨、尿素、尿酸、可溶性磷等物质，且氨氮（NH4+-N）占总排泄量的60%～70%，因此在河蚌-菹草湿地系统中，河蚌是通过扰动、强化基质中微生物的作用来去除水中NH4+-N，其本身没有起到净化NH4+-N的作用。霍元子等［14］向上海市滴水湖修复区投放大型溞，利用大型溞滤除水体悬浮物和藻类，提高水体透明度，之后再移栽伊乐藻、轮叶黑藻等沉水植物，通过长期监测发现，水体中TN、NH4+-N和TP等水质指标的浓度均显著低于未实施修复的对照区，水体长期维持在国家Ⅱ到Ⅲ类地表水标准内。马进等［15］将沉水植物苦草和大型溞联合使用，建立草-溞处理系统修复富营养化池塘水体，结果表明，经过草-溞处理系统处理后的水中氮、磷营养盐大幅度下降，水体透明度显著提升；除此之外，经过41 d的处理之后，草-溞联合处理中苦草湿重增长率（740%）显著高于单一使用苦草时的增长率（470%），说明大型溞对苦草的生长有促进作用。

现有研究中对生物操纵已有一定的成果，但对生物操纵是否能够有效抑制产毒蓝藻，滤食性动物在修复水体时的添加密度是否会影响其对水华的抑制作用，水生植物修复和生物操纵能否完全相辅相成，此类生物修复过程中对水体浮游细菌群落结构会造成何等影响等问题，仍需进一步讨论和研究。

1 材料与方法

1.1 试验水体来源

原水取自天津市宁河区某农田周边的富营养化池塘，其水质参数：TN为（7.03±0.35）mg/L，TP为（0.28±0.03）mg/L，叶绿素 a含量为（272±13）μg/L，经计算，综合营养状态指数为79.81，参考富营养化评级标准［15］，判断其为重度富营养化水质。

将上述水体用13号浮游动物网滤除水中原有的大型浮游动物，并用灭菌后的BG-11（4%）培养液按1∶1稀释。BG-11培养液组成见表1。稀释后，其TN、TP浓度与原水的TN、TP浓度一致；而原生浮游植物和细菌群落稀释为原水含量的一半，为浮游植物和细菌群落保留一定的生存空间，以此作为本试验的供试水体，考察试验设置对富营养化池塘中原生浮游植物和细菌群落的影响。试验水体初始水质为pH 8.77、溶解氧（DO）9.28 mg/L、透明度17.20 cm、TN 7.38 mg/L、TP 0.31 mg/L、NH4+-N 0.21 mg/L、硝氮（NO3--N）6.59 mg/L、叶绿素 a 68.59 μg/L、浮游植物密度2.80×107cells/L、蓝藻门密度2.52×107cells/L、微囊藻毒素2.77 μg/L。

表1 BG-11（4%）培养液组成

1.2 供试动植物

本着高摄食量、低排泄量且不会造成生物入侵的原则，选用大型溞（Daphnia magna）作为本试验的供试动物。大型溞溞种购自中国科学院沈阳应用生态研究所，试验前在试验室内扩大培养，将其置于盛有供试水体的1 L锥形瓶中，在人工气候箱内驯化培养60 d以上，驯化温度为25℃，光照度为1 200 lx，光暗比12 h∶12 h，每日喂食20 mL斜生栅藻藻液，隔日换水。试验前通过孔径2 mm的水溞滤网过滤选取个体尺寸一致、活泼健康的子代，在纯水中清养24 h，使其尽量排空肠道后用于试验。

综合考虑水生植物的经济性和环境友好性，供试植物选择粉绿狐尾藻（Myriophyllum aquaticum）和金鱼藻（Ceratophyllum demersum）作为本试验的供试植物。粉绿狐尾藻和金鱼藻购于天津市某花鸟鱼虫市场，试验前在4%的BG-11培养液中驯养15 d，使其适应试验环境，再选取生长良好且大小相似的植株用于试验。

1.3 试验装置

试验装置（下称试验桶）为33个PVC圆桶，容积为20 L。试验前使用75%乙醇灭菌，并用去离子水反复冲洗（图1）。

图1 试验装置

1.4 试验设计

采用日光灯模拟春、夏时期的日光光照，光照度为（1 200±100）lx，光暗比为12 h∶12 h。将供试水体充分混匀后分装至各个试验桶内，初始水位均为20 L，剩余水体用于各指标检测，以此作为试验0 d时的初始值。在每个试验桶内设置相同的恒温加热棒，温度均设置在25℃，并用温度计监测水温，以确保试验水温恒定，试验时间为20 d。试验设置均基于预试验的结果优选而得，共计9个处理：CK，不投加动植物对照；处理A、B分别投加高、低2种不同密度的大型溞；处理C、D分别投加相同湿重（60 g）的狐尾藻、金鱼藻；处理E、F、G、H为高、低密度大型溞和与2种植物两两组合即草-溞联合，每组均设有3个平行试验桶，具体设置见表2。

表2 试验设置

1.5 样品的采集与测定

1.5.1 样品的采集 在试验2、5、10、15、20 d时，测定水体pH、DO、TN、TP、NH4+-N、NO3--N。采样时间为上午8：00—9：00，为减少试验误差，在每次取样后记录水位，在下次取样前采用蒸馏水补足蒸发量［16-18］。

1.5.2 样品的测定 ①pH、DO。采用双输入多参数数字分析仪（HACH HQ40d，USA）对试验水体原位测定，在各平行试验桶底部0～20 cm、20～40 cm处分别测定后取平均值。②TN、TP、NH4+-N、NO3--N浓度。取水样20 mL，营养盐指标采用流动分析仪测定。TN浓度采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法测定；TP浓度采用钼锑抗分光光度法测定；NH4+-N浓度采用纳氏试剂光度法测定；NO3--N浓度采用酚二磺酸光度法测定。③大型溞密度。使用玻璃棒搅拌混匀水体，取1 L水样采用3%的甲醛溶液固定并浓缩至50 mL，采用1 mL计数框于显微镜100×下定量计数，每个样品均计数3次后取平均值。④植物湿重。将各试验桶中的水生植物取出，用滤纸吸干表面的水分后，采用电子天平称重，每个样品称3次取平均值。

理化指标的消减率计算公式为：

式中，C0为某指标的初始浓度，Cx为该指标在第x天的浓度。

1.6 数据统计分析

各项指标采用Origin 9.0制图，数据均以3个平行试验桶的平均值±标准差形式表示。采用SPSS 24.0进行统计分析，通过单因素方差分析（one-way/ANOVA）检验指标的差异显著性，图基检验（HSDtest）用于单因素方差分析后的两两比较，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 对水体pH、DO的影响

2.1.1 对pH的影响 试验期间各处理水体的pH变化如图2所示。由图2可知，不同处理对水体pH的影响不明显，pH均在8.2～9.3波动，各组pH差异均不显著（P＞0.05），整体处于偏碱性状态。研究表明，水体处在偏碱性环境中有利于微生物的硝化作用、NH4+-N的挥发和TP的去除，但pH过高会影响植物对营养盐的吸收作用［19-21］。大型溞的呼吸作用会向水中释放CO2降低水体pH，但沉水植物的光合作用可向水中释放O2，缓解了大型溞对pH的降低作用。

2.1.2 对DO的影响 试验期间水体DO浓度变化如图3所示。由图3可知，DO浓度随时间变化存在组间差异（P＜0.05）。与CK相比，处理A、B中的DO浓度随时间变化波动较大。试验期间，CK的DO浓度波动不明显，维持在8.4～9.9 mg/L；处理A、B在0～5 d时均发生较大幅度的下降，5 d时分别降至7.21、7.19 mg/L；10～15 d时，处理A、B的DO浓度变化不稳定，15 d时分别降至6.34、5.47 mg/L；试验结束（20d）时，处理A、B的DO浓度有所回升，分别升至6.52、5.89 mg/L，但仍显著低于CK（P＜0.05）。处理C、D与CK之间存在显著差异（P＜0.05），试验结束时，表现为D（5.72 mg/L）＜CK（9.09 mg/L）＜C（10.03 mg/L），两两比较（HSDtest）表明，处理C的DO浓度显著高于处理D（P＜0.05），这是由于狐尾藻较金鱼藻具有庞大的根系系统［22］，其强大的释氧作用可使水中DO浓度显著提升。处理G、H的DO浓度显著低于处理E、F和CK（P＜0.05）；处理E、F与CK则无显著差异（P＞0.05）。推其原因，一方面是对照浮游植物大量繁殖，采样时均在光照期，浮游植物通过光合作用产生了大量氧气；另一方面是大型溞的呼吸耗氧量高于金鱼藻的释氧；在试验10 d之后，处理G、H的DO浓度开始回升，试验结束时分别恢复至7.63、7.12mg/L。这是由于后期金鱼藻生长加快，叶茎组织逐渐庞大，此时金鱼藻的释氧高于大型溞的耗氧所致。

图2 不同处理对水体pH的影响

图3 不同处理对水体DO的影响

2.2 对水体氮素营养盐的影响

2.2.1 对TN的影响 对试验期间各处理水体中TN浓度进行监测，其变化规律如图4所示。由图4可知，各处理水体中TN浓度随处理时间延长均呈下降趋势，且均在20 d时降至最低。处理A、B水体中TN浓度与CK均有所差异。试验0～10 d时，处理A、B中的TN浓度均高于CK，10 d之后，TN浓度迅速下降。试验结束时，各处理和对照的TN浓度由低到高依次为 C（1.65 mg/L）、E（1.88 mg/L）、F（2.35 mg/L）、D（3.18 mg/L）、G（3.59 mg/L）、H（3.86 mg/L）、A（4.57mg/L）、B（4.80 mg/L）、CK（5.22 mg/L），此时对应的TN消减率为CK（29.27%）＜B（34.96%）＜A（38.08%）＜H（47.69%）＜G（51.36%）＜D（56.91%）＜F（68.16%）＜E（74.53%）＜C（77.64%），且处理C、E、F对TN的消减率均显著高于D、G、H、A、B、CK。

图4 不同处理对水体TN的影响

图5 不同处理对水体NH4+-N的影响

2.2.2 对NH4+-N的影响 对试验期间各处理水体中NH4+-N的浓度进行监测，其变化规律如图5所示。由图5可知，试验期间，各处理NH4+-N浓度呈现不同的趋势，C、D、E、F在20 d时有所下降，其余各处理则呈上升趋势。试验结束时，各处理水体中的NH4+-N浓度由低到高依次为C（0.11 mg/L）、E（0.13 mg/L）、F（0.18 mg/L）、D（0.19 mg/L）、G（0.24 mg/L）、H（0.28 mg/L）、CK（0.34 mg/L）、A（0.36 mg/L）、B（0.44 mg/L），仅处理A和B中的NH4+-N浓度高于CK，并达到统计学上的显著水平（P＜0.05）。处理C和E对NH4+-N的消减作用最明显，且处理E（38.10%）较处理F（14.29%）消减作用更为显著（P＜0.05）。

2.2.3 对NO3--N的影响 对试验期间各处理水体中NO3--N的浓度进行监测，其变化规律如图6所示。由图6可知，各处理NO3--N浓度随处理时间呈下降趋势，试验结束时，NO3--N浓度由低到高依次为 E（1.62 mg/L）、F（1.89 mg/L）、C（1.91 mg/L）、D（2.69 mg/L）、G（3.76 mg/L）、H（3.84 mg/L）、A（3.98mg/L）、B（4.08 mg/L）、CK（4.42 mg/L），所对应的NO3--N消减率由高到低依次为E（75.42%）、F（71.32%）、C（71.02%）、D（59.18%）、G（42.94%）、H（41.73%）、A（39.61%）、B（38.09%）、CK（32.93%）；各处理对NO3--N的消减率均显著高于对照（P＜0.05）；两两比较（HSDtest）显示，处理E、F对NO3--N的消减率均显著高于G、H。由“2.2.1”可知，处理E、F对TN的消减率也均显著高于G、H，说明不同密度大型溞与狐尾藻的联合（处理E、F）对TN和NO3--N的消减作用较其与金鱼藻联合处理时更优。

图6 不同处理对水体NO3--N的影响

2.3 对水体磷素营养盐的影响

对试验期间各处理水体中TP浓度进行监测，其变化规律如图7所示。由图7可知，试验期间，处理G、H的TP浓度总体呈先上升后下降的趋势；处理E、F的TP浓度呈持续下降趋势。各处理TP浓度均在试验结束时降至最低，此时，各处理和对照之间的TP浓度从低到高依次为C（0.06 mg/L）、E（0.09 mg/L）、D（0.11 mg/L）、F（0.12 mg/L）、G（0.14 mg/L）、A（0.15 mg/L）、H（0.16 mg/L）、B（0.18 mg/L）、CK（0.20 mg/L），此时各处理对应的TP消减率由高到低依次为C（80.65%）、E（70.97%）、D（64.52%）、F（61.29%）、G（54.84%）、A（51.61%）、H（48.39%）、B（41.94%）、CK（35.48%）。其中，处理E、F的TP消减率显著高于CK（P＜0.05），处理 G、H 则与 CK 差异不显著（P＞0.05）。结果表明，大型溞和狐尾藻联合处理对TP的消减作用明显高于大型溞和金鱼藻联合处理。处理C、D对TP消减率显著高于CK，且处理C对TP的消减率显著高于处理D（P＜0.05）。

图7 不同处理对水体TP的影响

3 讨论

大型溞对水体pH的影响较小；受呼吸作用影响，水体DO浓度随溞浓度增大而降低。狐尾藻和金鱼藻对水体pH影响较小。试验期间，金鱼藻的DO浓度低于对照；而狐尾藻由于其强大的根系释氧作用可以显著提升水体的DO浓度。草-溞联合处理对水体pH的影响较小。相比于对照，大型溞+狐尾藻对水体DO浓度的影响较弱。试验0～10 d时，由于金鱼藻释氧作用低于大型溞的呼吸作用，致使大型溞+金鱼藻处理水体DO浓度显著降低；10 d后金鱼藻叶茎壮大，DO浓度回升。

大型溞可以通过摄食水中的浮游植物、颗粒物来同化营养盐，因而对TN、TP、NO3--N等营养盐均有一定的消减作用。与此同时，对照中浮游植物大量繁殖也对N、P营养盐有一定消耗。因此，大型溞的添加对营养盐的消减与对照相差不显著。此外，大型溞作为动物，其机体对N、P营养盐的需求有限，未被吸收的N、P等物质将会以粪便的形式排出体外，从而引起水环境中N、P营养盐的回升。由于高密度大型溞排泄作用较大，在同等试验条件下，导致其N、P营养盐的浓度较低密度处理略高。研究表明，大型溞暴露在含有一定浓度产毒蓝藻的水环境中，其生长周期会缩短至 13～15 d［23］，低于试验周期所设定的时间（20 d）。此外，由于受到种群竞争因素的影响，试验过程中，大型溞群体均有死亡现象，死亡个体向水中释放NH4+-N，从而造成试验过程中NH4+-N浓度的升高。

沉水植物在生长过程中可吸收大量的营养盐，因此本试验中狐尾藻和金鱼藻对TN、TP、NO3--N、NH4+-N等的消减作用均较为明显。狐尾藻具有增长较快、对营养盐富集量大的特点，此外，还具有冠层优势，可以浮在水面充分利用光照条件快速生长，金鱼藻则是整个浸没在水体中，因而生长速度较慢，试验结束时狐尾藻组的平均湿重为（72.84±5.87）g，高于金鱼藻组的（63.52±9.43）g。狐尾藻根系庞大，输氧作用强，可以加强根系微生物的硝化-反硝化作用，而金鱼藻属于无固定根类型的植物，只能靠茎叶吸附水体营养盐，因此本试验结果中狐尾藻对各项营养盐的消减作用均高于金鱼藻。

相比于单一使用溞处理时对N、P营养盐无显著消减作用的现象，联合处理可明显降低营养盐的浓度。草-溞联合对水体营养盐的消减作用具有协同性，大型溞+狐尾藻对营养盐的消减作用均优于大型溞+金鱼藻，说明在营养盐的消减上，沉水植物起到主要作用。本试验结果中，低密度（25 ind/L）大型溞+狐尾藻对于TN、NO3--N、TP的消减作用与高密度（100 ind/L）大型溞+狐尾藻差别较小，说明大型溞对于营养盐的摄食和同化作用有限，试验中大型溞的排泄作用和死亡个体向水中释放了NH4+-N，但沉水植物的对营养盐的吸收作用，改善了NH4+-N上升的现象。研究表明，狐尾藻有亲氨性，对水中NH4+-N有较强的吸收作用［24］，这解释了处理E、F的NH4+-N浓度在试验后期下降的原因。

4 小结

近年来，水体富营养化现象日趋严重，已成为亟需解决的环境问题之一。本研究基于生物操纵理论和水生植物修复理论，结合目标水体现状，采用大型溞作为滤食性动物的代表，狐尾藻和金鱼藻作为沉水植物的代表，在实验室可控条件下，模拟春、夏水华易发生时期的光照和温度条件，考察单一生物及其组合对富营养化水体的修复效果，为生物操纵和水生植物修复富营养化水体的应用提供数据支持。试验结果表明，大型溞、狐尾藻、金鱼藻以及草-溞联合对水体pH均无显著影响；各处理均对水体DO有一定的改善效果；草-溞联合处理相比于单一溞处理可有效提升水中的DO浓度，其中大型溞+狐尾藻效果更优。大型溞对水体TN、TP和NO3--N消减作用不显著，投加密度对营养盐的消减作用影响较弱；NH4+-N浓度随大型溞投加密度的增高而上升；狐尾藻和金鱼藻对TN、TP、NO3--N、NH4+-N的消减作用显著，其中狐尾藻消减作用更优。草-溞联合处理均可显著消减水体中的TN、TP、NO3--N浓度，且明显优于单一溞处理时的抑制能力，其中以低密度大型溞+狐尾藻的消减作用最为显著。金鱼藻和狐尾藻均能够抑制因大型溞排泄和死亡致使的NH4+-N浓度上升，且狐尾藻的抑制作用更强。