十字花科植物黑斑病的研究进展

沈钰森 王建升 盛小光 赵振卿 虞慧芳 顾宏辉

(浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

十字花科 ( Cruciferae )， 又称芸薹科(Brassicaceae)，意为花朵呈十字形的植物，并且常具有辛辣味。十字花科是植物中最繁盛的科之一，包括很多蔬菜，如青花菜(Brassica. oleraceavar．italica)、花椰菜(B. oleraceavar．botrytis)、芥菜(B. juncea)、甘蓝(B. oleraceavar．capitata)、白 菜(B. rapa) 和 萝 卜(Raphanus sativus)，以及作为模式作物的拟南芥(Arabidopsis thaliana)等[1]。黑斑病在十字花科蔬菜上普遍发生，其致病菌可侵染植株的叶片、茎秆、角果和花球等，并在其表面形成同心轮纹的灰褐至暗褐色近圆形的病斑，造成蔬菜的品质和产量大大降低，尤其对青花菜、花椰菜等以花球为食用部分的蔬菜商品性造成了极大的影响。

目前在十字花科芸薹属栽培种中尚未发现对黑斑病具有高度抗性的材料或基因[2]，只在芸薹属的近缘物种，如亚麻芥(Camelina sativa)、荠菜(Capsella bursapastoris)、白芥子(Sinapis alba)、芝麻芥(Eruca sativa)和拟南芥中发现了一些高抗性的种质资源[3-4]。亚麻芥、荠菜和拟南芥中的抗菌类物质camelexin，可以抑制黑斑病毒素腐败菌素B(destruxin B，也称绿僵菌素、破坏素)的产生[5-6]；白芥子可以通过羟基化和糖基化作用将腐败菌素B 降解[7-8]；芝麻芥中可能存在较高含量的多酚和黄酮类物质，对黑斑病产生了抗性[9]。此外，不同生态型的拟南芥中camalexin 含量不同，使得拟南芥对黑斑病的抗性存在差异[10]。拟南芥与黑斑病的互作研究已成为揭示死体营养型病菌致病机理的理想模型[11]。

本文重点综述了十字花科植物受链格孢属真菌侵染过程中，植物与真菌体内发生的一系列生理生化反应，以及相关的调控过程。这些研究不仅有助于在蔬菜抗病育种中采取有效的防控措施，也能从分子水平上对蔬菜种质进行遗传改良，获得优良抗病品种。

1 黑斑病病原研究

1.1 病原分类

引起十字花科黑斑病的链格孢属真菌，是一种死体营养型致病菌，主要通过无性孢子繁殖[12]。在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar， PDA)培养基上，链格孢菌的菌落会形成绒状或带粉状同心圆，菌丝灰色至黑色，生长迅速且扩散快；链格孢菌具有多种形态的分生孢子，呈现链状或分枝形态。孢子在基部附近最宽，逐渐变细成一个拉长的“喙”[1]。

根据真菌的孢子形态特征和侵染寄主的种类，侵染十字花科蔬菜的链格孢属真菌分为甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)，芸薹链格孢菌(A. brassicae)和萝卜链格孢菌(A. raphani)3 种专化型[13]。通常认为，甘蓝链格孢菌主要侵染甘蓝类蔬菜，芸薹链格孢菌主要侵染白菜类蔬菜，萝卜链格孢菌主要侵染萝卜属蔬菜。但也有报道称，甘蓝链格孢菌和芸薹链格孢菌的寄主范围并没有明确的界限，只是对特定的寄主而言，两类链格孢存在的变异范围不同，或是它们的为害时节存在差异[14]。

1.2 黑斑病原基因组

目前已公布的甘蓝链格孢菌基因组有2 个，被测序的菌株分别是ATCC 96836 和Abra43。2009年公布的ATCC 96836 基因组大小为29．53 Mb，包含3 280 个scaffolds，预测到10 514 个基因；2017年公布的Abra43基因组大小为31．03 Mb，包含29 个scaffolds，共预测到12 456 个基因[15]。2019年，Rajarammohan 等[16]利用三代Nanopore MinION 测序技术，对芸薹链格孢菌的分离株J3 进行基因组测序，组装获得包含17 个contigs 的34．14 Mb 基因组序列。

由于绝大多数的链格孢菌缺乏有性阶段[1，11]，通过正向遗传学手段研究链格孢菌基因组较为困难，因此，基因突变或敲除等反向遗传学方法成为探究其致病机理的重要手段。研究发现，很多目标基因的突变未能改变其致病力，这可能与这些基因存在功能冗余有关[17-18]。

在已报道的病原菌功能基因中，很多与孢子的细胞壁有关，如非核糖体多肽合成酶基因AbNPS2 能专一性地在生殖发育阶段的分生孢子中编码一个由7 195个氨基酸组成的大型蛋白；该基因突变能影响孢子的细胞壁形态，降低孢子的萌发率，从而使病菌的致病力下降[19]。链格孢菌转录因子AbPf2 能在早期侵染过程中诱导106 个病菌基因的响应[20-21]，包括果胶裂解酶基因PL1332；研究发现，PL1332 的突变可以使致病菌的致病力降低约30%[20]。锌指蛋白转录因子AbVf19 能调控孢子的细胞壁降解酶基因；当AbVf19 被敲除后，病原菌对宿主植物的致病力显著降低[22]。虽然有些基因的突变能使孢子的细胞壁结构发生异常，但对其致病力却没有显著影响，如编码黄酮单加氧酶的基因AbMak1 能影响分生孢子的亲水性粘附及其表面硬度，而对孢子自身的生长与繁殖影响很小[23]。有些基因突变后使链格孢菌的致病力增强，如参与黑色素生物合成的信号途径基因Amr1 突变后，黑色素无法正常合成，但果胶作为碳源在细胞壁中的利用效率比野生型更高，使得其致病力更强，病斑大小是野生型的2 倍[24]。

影响病原菌的生长与繁殖是改变其致病力的常见手段。如非核糖体多肽合成酶基因AbrePsyl，可能参与了毒素或病菌生长所需的铁载体的合成，使得它们在植病互作中的基因表达量明显提高[25]；病原菌菌丝融合基因Aso1 受突变后，影响了菌落形成过程中分生孢子的营养与水分获取，降低了其致病力[26]；参与未折叠蛋白反应(the unfolded protein response，UPR)信号途径的基因AbHacA受突变后，能降低真菌吸收宿主环境中生长所需营养物质的能力，也能降低病菌致病力[27]。

在病原菌与植物的互作过程中，病原菌会分泌毒素，植物能产生抗毒素(如camalexin、芸薹宁和异硫氰酸盐等)抵御病菌侵染。但病原菌中存在丝裂原活化蛋 白 激 酶 类 ( mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，可受植物抗毒素激活，以保护真菌免受植物抗毒素的侵染。一方面，受camalexin 激活的MAP 激酶基因AbHog1、AbSlt2 或MAPK 激酶基因AbSte7 的缺失突变，可以使甘蓝链格孢菌的致病力明显下降[28-30]；另一方面，植物抗毒素芸薹宁降解酶基因Bdtf1 的突变[31-32]，或者降解异硫氰酸盐的谷胱甘肽转移酶基因AbGSTO1[33]的突变，也能使病原菌的致病力下降。

这些致病基因(或编码的蛋白)可能与植物中某些基因或蛋白存在直接互作，也可能是相关途径的代谢产物与植物存在互作。基于病原菌的致病因子发掘植物中的互作因子，并应用基因工程手段提高植物对病原菌的抗性，对于缺乏抗病基因的植物来说尤为重要；此外，这些致病基因或蛋白还可以作为药物靶点，用以开发新的防治农药。

1.3 病原毒素相关研究

黑斑病的发生与链格孢菌产生的毒素具有密切的关系。作为死体营养型致病菌，链格孢菌在侵染植物时，首先通过释放毒素诱导侵染处植物细胞的程序性死亡，再通过细胞壁降解酶等分解死亡的细胞[34]。链格孢菌能产生两类毒素，即寄主选择性毒素(hostselective toxin， HST)和非寄主专化性毒素(nonspecific toxin， NHST)。已报道的HST 至少有13 种[35]，其中芸薹链格孢菌或甘蓝链格孢菌产生的HST 被称为“AB-毒素”。不同的是，大多数的链格孢毒素是低分子量的次级代谢物，而AB-毒素被认为是35 kDa 的蛋白质[35-36]；大多数的链格孢毒素能在具有孢子萌发液的培养基上产生，而AB-毒素只能在孢子侵染宿主植物的早期产生，不能在非宿主植物或培养基上产生，这可能与AB-毒素的产生需要受宿主植物中的寡糖诱导有关[37]。

一般认为，AB-毒素包含4 种组分：腐败菌素B、高腐败菌素B(homodestruxin B)、腐败菌素B2(destruxin B2)和脱甲基腐败菌素B(desmethyldestruxin B)[38]。其中，腐败菌素B 是AB-毒素的重要组分，较低浓度的腐败菌素B 就能对芸薹属植物的正常生理功能产生干扰，并且这种敏感性会随着与芸薹属植物进化距离的增加而降低[39]。Parada 等[38，40]认为腐败菌素B 是NHST，并且发现了一种区别于AB-毒素的新的HST 蛋白，即ABR-毒素。与AB-毒素类似，ABR-毒素是一种27．5 kDa的蛋白质。

与AB-毒素生物合成相关的基因鲜见报道[34]，而在其他类似毒素物质的研究中，相关调控基因被发现，如甘蓝链格孢菌基因Abpks9 能与其他4 个基因(DEP2，DEP3，DEP4，DEP6)共同参与合成一种组蛋白去乙酰化抑制剂Depudecin。将这5 个基因突变之后，影响了Depudecin 的合成，从而使甘蓝链格孢菌的致病力下降10%[41]。表1总结了链格孢菌中与其致病力相关的基因。

表1 链格孢菌中与其致病力相关的基因Table 1 Genes related to the pathogenicity of Alternaria spp.

2 植物对链格孢菌的防御

2.1 植物先天性免疫

在长期的进化过程中，植物建立起了一套复杂的机制来抵御各种病原菌的侵染[46]，整个过程可分为4个阶段：(1) 植物通过模式- 识别受体(pattern recognition receptors， PRRs)，识别不同类型的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs) 或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，从而产生模式触发免疫(pattern-triggered immunity，PTI)，以抵御病菌侵染。(2)部分(未被识别的)病菌能产生效应因子干扰PTI过程，使植物产生效应因子触发的感病反应(effectortriggered susceptibility，ETS)。(3)某些效应因子能被植物中包含核苷酸结合及富含亮氨酸重复(nucleotide binding-leucine rich repeat， NB-LRR)结构域的蛋白识别，引起植物产生效应因子触发的免疫反应(effectortriggered immunity，ETI)，并且会造成受侵染部位一定程度的过敏性细胞死亡。(4)受到自然选择的作用，部分病菌无法被植物中的蛋白所识别，或者具有另外的蛋白抑制ETI 过程，从而再次触发植物新一轮的ETI 反应[47-48]。

在PTI 中，PRRs 如何识别PAMPs 和DAMPs 的过程比较复杂，也是研究的热点。PRRs 包括受体蛋白激酶(receptor-like kinase proteins，RLKs)和受体蛋白(receptor-like proteins，RLPs)两种[48]。PAMPs 主要有几丁质、鞭毛蛋白、糖蛋白、脂多糖等[49]。其中，几丁质是真菌细胞壁的组成部分，植物对几丁质的识别需要LYK(lysM-containing receptor-like kinase)基因的参与。当LYK4 基因突变时，拟南芥对甘蓝链格孢菌的识别能力减弱，使得抗性显著降低[50]。DAMPs 主要有寡聚半乳糖醛酸、 多肽和植物磺肽素(phytosulfokines，PSKs)[48]。拟南芥中PSK 受体PSK1突变后能增强活体营养型真菌的抗性，但同时会抑制茉莉酸响应基因的表达，使其对甘蓝链格孢菌抗性减弱[51]。此外，自噬作用在植物对病原菌的基础免疫中起着重要作用，当自噬相关基因ATG5、ATG10、ATG18a突变后，拟南芥对甘蓝链格孢菌的抗性显著降低[52]。

在ETI 中，抗性R 基因需要编码病程相关(pathogenesis-related，PR)蛋白识别病原菌分泌的效应蛋白。近年来，关于PR 基因的转录组研究有较多报道，如当芥菜受芸薹链格孢菌侵染后，芥菜BjPR1 基因能响应生物(病菌)和非生物(创伤)胁迫，并且在叶片侵染处和叶片末端非侵染处都能发现BjPR1 上调表达，表明该基因在SAR 过程中起着重要作用[53]；BjPR2 能编码β-1，3-葡聚糖酶，催化病原菌细胞壁中β-1，3-葡聚糖的水解，破坏病原菌细胞结构，从而使植物不受病原菌的侵染[54]。另外，在拟南芥PR-12 like 的3 个基因中，只有At2g26020 在芸薹链格孢菌侵染和非侵染部位的表达量显著提高，表明该基因是参与黑斑病ETI 途径的重要基因[55]。

2.2 植物激素防御

在植物对病原菌的防御过程中，水杨酸(salicylic acid， SA)、茉莉酸(jasmonic acid， JA) 和 乙 烯(ethylene， ET)等植物激素起关键的调节作用。活体营养型和死体营养型病菌对植物的侵染模式不同，植物抵御这两类病菌的方式也有所不同。一般认为，活体营养型致病菌能诱导植物的SA 信号途径，而死体营养型致病菌能诱导植物的JA/ET 信号途径[56]。由于激素与激素之间往往存在着信号交互作用，上述划分也并非是绝对的[57-59]。甚至，植物对致病菌的抗性并不取决于某种特定的信号途径，而更取决于信号交互作用的方式[60]。

链格孢属真菌作为一种死体营养型致病菌，主要能诱导植物的JA 信号途径。当植物受病菌侵染后，JA 含量迅速积累，被其“核受体”COI1 识别，在转录中介体(Mediator)MED25 和CDK8(cyclin-dependent kinase 8)的作用下，释放核心转录因子MYC2 (jasmonate insensitive 1)的活性，进而激活病程相关基因，如PDF1．2、HEL和CHI-B编码具有抗菌活性的蛋白质[61-64]；在拟南芥中，除DiG(Dijon G)等少数生态型外，几乎所有的生态型对甘蓝链格孢菌都具有抗性[65]。但是，JA 信号途径突变体coi1 和植保素camalexin 突变体pad3 对甘蓝链格孢菌敏感。外源施加JA 后，拟南芥突变体对甘蓝链格孢菌的抗性显著提高[66]。

ET 与JA 之间存在着交互作用。ERF1(ethylene response factor1)是调控ET 与JA 信号途径的重要转录因子。ERF1 既是ET 信号途径的下游调控基因[67]，也是JA 处理后的早期响应基因[61]。随后发现组蛋白乙酰化基因HDA19(histone deacetylase19)的超表达能激活ERF1，并提高拟南芥对甘蓝链格孢菌的抗性[68]。另一种与ET 和JA 信号交互有关的基因GLIP1，能调控脂肪酶的分泌，突变后对甘蓝链格孢菌的抗性明显减弱[69]。

SA 与JA 之间也存在着交互作用。当SA 信号途径或ET 信号途径受损后，并不能改变拟南芥对甘蓝链格孢菌的抗性[70]。但在拟南芥突变体受甘蓝链格孢菌侵染后，外施SA 会抑制JA 对病菌的响应，使抗性减弱[66]。SA 与JA 之间的交互作用受很多调控因子影响，如NPR1，不仅能激活SA 介导的PR基因的表达，还能抑制JA 合成与响应基因的表达[71]。拟南芥转录因子WRKY33 也能影响SA 和JA 的交互作用，该基因的超表达能增强PDF1．2 的表达水平[72]。

此外，细胞分裂素(cytokinin，CTK)[73]、生长素(auxin， IAA)[46]和脱落酸(abscisic acid， ABA)[74]也是影响植物对黑斑病抗性的重要激素，并且外施上述激素可提高对黑斑病的抗性。研究发现，IAA 与ABA之间也可在ARF10 的诱导下发生交互作用，共同参与白芥子中对甘蓝链格孢菌的抗性[75]。

2.3 植物抗菌类物质

病原菌产生毒素侵染植物时，植物会产生抗菌类物质进行防御。其中，植物抗毒素(phytoalexin)是植物在受到胁迫(包括病原体侵袭)时诱导产生的一类抗菌类物质，通常属于次生代谢产物[76]。已报道的十字花科抗毒素至少有44 种，并且大多数是(S)-色氨酸和(S)-苯丙氨酸的衍生物[77-78]。在链格孢菌与十字花科植物互作过程中，主要产生的植物抗菌类物质包括植保素camalexin、芸薹宁(brassinin)和异硫氰酸盐(isothiocyanates)等。

Camalexin 是拟南芥中最重要的一类抗菌类物质，是一种含硫的生物碱，最早在亚麻芥中被发现[79]，故又被称为亚麻荠素。当链格孢菌侵染拟南芥时，能诱导拟南芥产生camalexin 抵御病菌侵染，并且不同生态型的拟南芥中camalexin 的含量存在差异，表现为对链格孢菌的抗性差异[12]。研究表明，PAD是调控camalexin 的重要基因，拟南芥突变体pad3 无法诱导产生足够含量的camalexin，使得对链格孢菌的抗性明显减弱[80]。研究发现，camalexin 的合成及转运受到MPK3/MPK6-WRKY33 信号模块的调控，有助于camalexin 被诱导合成后快速转运出植物细胞，发挥其抗菌效应[81]。

芸薹宁不仅是十字花科的抗毒素，还是某些毒素合成的前体，其抗菌活性主要源自它的二硫代氨基甲酸(dithiocarbamate)基团[82]。在真菌入侵的早期，芸薹宁能抑制或减缓真菌细胞的生长[83]。但同时，链格孢菌也能诱导产生芸薹宁水解酶BHAb，将芸薹宁降解成3-吲哚甲胺(3-indolylmethanamine)[82]，这种“解毒酶”使植物更容易遭受病菌侵染。为此，需要寻找一种“解毒酶” 的抑制剂——paldoxins(phytoalexin detoxification inhibitors)用于病害防控[84]。目前已发现吲哚和萘甲酸甲酯是合成paldoxins 的前体物质[85]。

异硫氰酸盐是芥子油苷的降解产物，广泛存在于十字花科蔬菜中。对包括5 种异硫氰酸盐的17 种芥子油苷及其降解产物的抗菌性研究发现，异硫氰酸盐具有良好的抑菌效果[86]。与camalexin 和芸薹宁相比，异硫氰酸盐对链格孢菌的敏感性较弱，且在不同分离株中存在变异[87]。

2.4 植物酶类在抗黑斑病中的作用

植物酶类在植物对病原菌的识别和响应过程中起着十分重要的作用。在十字花科蔬菜抵御黑斑病的过程中，已报道的酶类包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase， MAPK)[88-91]、 过氧化酶(peroxidases)[92]、抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AO)[93]和胼胝质合成酶(callose synthase)等[57]。

在植物受病原菌侵入早期，MAPK 级联反应在感知和传递PAMPs 信号过程中起着关键作用，包括相关激素的合成和信号传导，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，气孔的关闭，防御基因的激活，植物抗毒素合成，细胞壁的加固和过敏反应等[88]。如在激素调控方面，拟南芥MPK4 基因不仅能调控SA信号通路，也能调控ET/JA 信号通路。mpk4 突变体由于阻断了ET/JA 信号通路，使拟南芥对甘蓝链格孢菌的抗性减弱[89]；在抗毒素合成方面，植物受到云薹链格孢菌侵染后，信号识别受体诱导下游MAPK 信号级联反应，从而激活camalexin 的合成和积累，用以抵御病害侵染[90-91]。

细胞壁过氧化物酶参与拟南芥中ROS 的爆发。ROS 在植物细胞受病原菌侵染后产生，造成细胞坏死，有助于死体营养型真菌的侵染。将拟南芥中过氧化酶基因PRX33 和PRX34 敲除，再接种甘蓝链格孢菌后，ROS 产生量减少，菌斑变小，植株表现出抗病性[92]。AO 属于蓝铜氧化酶家族的糖蛋白，不仅能调控细胞壁的伸长生长，也能调控ROS 介导的信号传导过程。在不结球白菜(Brassica campestrisssp． chinese Makina cv． suzhouqing)中接种芸薹链格孢菌后，BcAO基因的表达水平显著提高，表明BcAO在不结球白菜抗黑斑病过程中起着重要作用[93]。

此外，拟南芥中的胼胝质合成酶[57]、凝集素受体激酶[94]以及白芥子中的糖基水解酶[7]等，分别能通过影响细胞壁组分、信号传导和激素响应从而影响植物对黑斑病的抗性。

在病原菌中寻找抵御病原菌的酶类，通过转基因的方式在植物中合成利用，也是提高植物抗病性的一种方法。如几丁质酶基因转到青花菜[95]、芥菜[96]和芝麻芥[97]中，合成的几丁质酶可以降解链格孢菌细胞壁，从而对黑斑病产生不同程度的抗性。茄科中的甾醇糖基转移酶基因WsSGTL1 转到拟南芥中，可以影响拟南芥膜甾醇的糖基化模式，增强糖基生物碱和糖基酚类化合物，阻碍ROS 和自由基的产生，也能增强对甘蓝链格孢菌的抗性[98]。表2 总结了十字花科植物中与黑斑病相关的基因。

3 小结与展望

引起十字花科黑斑病的链格孢属真菌属死体营养型致病菌，其侵染过程首先通过释放毒素诱导侵染处植物细胞的程序性死亡，再通过细胞壁降解酶等分解死亡的细胞。同时，宿主植物主要通过JA 信号途径和抗菌类物质(如camalexin 等)对链格孢菌进行防御。利用基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学的技术，研究者们已从拟南芥突变体中鉴定出大量参与植物—病原菌互作过程的基因、转录因子、酶和代谢产物。表1 和表2 分别总结了链格孢菌和十字花科植物中与抗黑斑病相关的致病基因和抗病基因。从已有的报道中可推断，植物与黑斑病菌互作的过程可能相当复杂，尤其是植物对病菌的信号识别、传导及激素间信号互作模式等方面尚未明晰。在这些方面进一步开展研究，丰富对植物免疫系统及其作用机制的认识，将成为今后抗病研究的重点内容。

尽管拟南芥和重要农作物中对抗病机理的探索与实践已经取得了重要进展，但对于十字花科蔬菜中黑斑病的研究还需进行探索。本研究认为，可从以下几个方面开展工作：第一，挖掘抗病种质资源。目前十字花科蔬菜中缺乏抗黑斑病种质或基因源，严重制约了后续抗病育种工作。虽然已有研究者尝试利用远缘杂交的方法从近缘野生种中获得抗病基因[2，4，118]，但后代中存在抗性不稳定的现象[118]，且技术耗时费力，难以在育种中利用。今后可以尝试构建与筛选突变体库[119]，或者通过CRISPR/Cas9 等基因编辑手段获得抗病资源。第二，加强植病互作研究。目前对植物与黑斑病的互作研究主要集中在模式植物拟南芥，对其他十字花科蔬菜中的互作机制研究需要加强，并加以利用。如可通过基因敲除等反向遗传学方法改变病原菌基因功能，使其致病力降低甚至丧失；还可利用多组学联合分析技术挖掘与抗黑斑病相关的基因与转录因子，在十字花科蔬菜中育成抗病材料。第三，聚焦抗菌类物质。拟南芥、亚麻芥和荠菜中因自身的抗菌类物质camalexin，使其对黑斑病具有一定抗性。然而，十字花科栽培种中并不存在camalexin[78]，而具有另一类重要的抗菌类物质——异硫氰酸盐。虽然已有研究认为异硫氰酸盐对黑斑病具有抗性[86-87]，但对其作用机理尚不清楚。作为芥子油苷的降解产物，异硫氰酸盐在青花菜不同品种中存在较大的遗传变异[120]。探究芥子油苷代谢的分子机制及其与黑斑病的关系，将可能成为十字花科蔬菜抗黑斑病研究的重要突破口。有报道称，肉桂皮、百里香、丁香、柠檬草和玫瑰草等植物精油能对蓝莓中的链格孢菌(Alternaria alternata)具有不同程度的抑菌活性[121]，这为探索十字花科植物新的抗菌类物质提供了参考。