马铃薯A病毒不同分离物的侵染鉴定及致病力分析

张 威，魏旭言，高艳玲，范国权，邱彩玲，孙旭红，武新娟，张俐俐，白艳菊*

（1.黑龙江省农业科学院，黑龙江 哈尔滨 150086；2.昭通学院农学与生命科学学院，云南 昭通 657000）

病毒病一直以来都是危害马铃薯生产，导致块茎减产并影响品质的主要因素。目前，侵染马铃薯的病毒约有50 余种[1,2]，其中马铃薯A 病毒（Potato virus A，PVA）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员[3]，也是常见的侵染马铃薯主要病毒之一。一般情况下，PVA 单独侵染马铃薯严重时减产可达40%左右[4]，而当PVA 与其他病毒复合侵染，可导致更严重的产量损失[5-7]。所以PVA 的危害性已经受到世界各国的重视，多个国家将其列为检疫性有害生物，中国2007 年也将PVA 列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》[8]。国内马铃薯PVA 的相关研究多集中在病毒检测和分离鉴定方法上，且已初步取得成果[9-11]，但对于PVA 不同分离物在马铃薯生长发育过程中引起的致病性研究较少。PVA 不同分离物因其核酸或所编码蛋白的差别，在马铃薯上引起的致病症状有所不同。明确PVA 分离物的致病力表现，从传统生物学症状着手，结合分子生物学方法，深入研究其致病性，可为PVA 病毒的鉴定与防治提供理论依据。

早在1990 年，Jones[12]对PVA 侵染马铃薯后引起症状与品种的关系就有报道，将PVA 接种到12 个马铃薯品种上，各品种敏感度不同，出现不被侵染、无症状感染、轻症状和重症状表现，而不同株系的PVA 在同一品种上的致病症状也有差异。本研究选择PVA 3 个遗传背景不同的分离物，分别接种在指示植物‘黄花烟’和较敏感马铃薯品种‘克新13号’上，观察其致病性差异，比较马铃薯植株体内病毒含量、叶片及块茎症状的表现，以明确3 个分离物对马铃薯生长发育的影响，对PVA 的鉴定及防治具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯原原种‘克新13 号’和指示植物‘黄花烟’（Nicotiana rustica），由原黑龙江省农业科学院马铃薯研究所提供。

PVA 3 个遗传背景不同的分离物2017-171、KB117 和2017-176，由原黑龙江省农业科学院马铃薯研究所测序并保存。

1.2 试验试剂

M-MLV 反转录酶试剂购自Promega 公司；RNA 酶抑制剂、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 均购自于Takara 公司；Trizol 提取液购自Invitrogen 公司；75%乙醇、异丙醇、氯仿、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 等试剂为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 植物种植

在智能温室中，按照珍珠岩∶炉灰∶草炭= 1∶1∶3的比例配制基质，混匀后121℃湿热灭菌30 min，冷却后装在口径为25 cm 的花盆中。浇透水后将‘黄花烟’的种子均匀撒播，覆土1.0 cm 左右，待苗长至2～3 cm 时分苗、移栽[13]。马铃薯块茎芽眼朝上栽到盆中再覆土。

1.3.2 摩擦接种

待植株4～6 叶期，选择在阴天或晚上，采用摩擦方式接种。在植株中上部两片对称叶上均匀喷洒适量碳化硅细粉，然后用棉签沾PVA 病毒汁液摩擦接种[毒源∶接种缓冲液（含32 mmol/L Na2SO3和 10 mmol/L 磷酸钠缓冲液，pH 7.5）=1 g∶3.3 mL]，30～60 min后清水冲洗掉残余病毒汁液[14]。

对照（Mock）植株用接种缓冲液摩擦接种叶片，方法同上。每个处理5 次重复。接种后避光过夜。取新生的系统叶片进行qRT-PCR 检测，确认是否已成功接种PVA，并系统侵染。

1.3.3 总 RNA 提取及 cDNA 合成

试验采用Trizol 法提取植物总RNA，操作步骤参考Trizol 使用说明书。提取后的RNA 采用紫外分光光度计测RNA 的OD260/OD280比值，当比值在1.8～2.0 说明RNA 的纯度较好，可以进行后续试验。先将其保存于-70℃备用。

取1 μg总RNA，使用Takara公司的M-MLV反转录试剂盒，参照说明书进行cDNA 合成，于-20℃保存备用。

1.3.4 TaqMan 荧光定量PCR 探针和引物的选择与合成

参考 Bright 等[15]PVA 的检测方法。PVA 的特异性探针和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探针PVA 102-probe 序列为：5′ -Texas-CACTACCAATGCTCAAAGGTAGAGTGTCG-BHQ-3′； 上 游 引 物 PVA102-F： 5′-TGTCGATTTAGGTACTGCTGGGAC-3′； 下 游 引物PVA102-R：5′- TGCTTTGGTTTGTAAGATAGCAAGTG-3′，扩增片段长度为132 bp。

1.3.5 TaqMan 荧光定量 PCR 扩增

反应体系为，模板cDNA 2 μL，上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L），探针 0.5 μL，10 ×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.20 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.25 μL，补水至25 μL。用水作为阴性对照，取浓度为 2.72 × 106copies/μL 的质粒作为阳性对照，每个样品3 次重复。反应程序：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环。将样品放入LightCycler®480 荧光定量仪进行TaqMan RT-qPCR 扩增。

2 结果与分析

2.1 PVA 不同分离物对指示植物‘黄花烟’的致病性差异

当接种‘黄花烟’第7 d 时，分别取新生叶进行PVA 的qRT-PCR 检测，检测结果均为阳性，表明PVA 3 个分离物可以成功侵染‘黄花烟’。随着时间的推移，其系统发病症状逐渐表现出来，图1 为接种15 d 后的症状表现。

不同分离物在‘黄花烟’上的症状表现各有不同（图1）。与对照相比，分离物2017-171 侵染‘黄花烟’后表现出叶片皱缩、泡斑和叶缘变形等症状；分离物KB117 侵染后，除了叶缘微皱缩外，还伴有明脉症状；分离物2017-176 侵染后叶片症状比较轻，仅表现微皱缩和点状轻花叶现象。通过3个分离物侵染‘黄花烟’后叶片的症状差异，可以初步推断他们的致病性具有一定差异。

图1 PVA 不同分离物接种‘黄花烟’的症状Figure 1 Symptoms of 'Rustica Tobacco' inoculated with different PVA isolates

2.2 PVA不同分离物对马铃薯品种‘克新13号’的致病性差异

2.2.1 PVA 不同分离物在‘克新13 号’植株体内病毒含量差异

分别在接种后的第2、5、10、15、20 和25 d取新生叶片，进行PVA的qRT-PCR检测。检测结果显示，3个分离物均可以成功侵染‘克新13号’。

每个分离物在6 个时间点病毒在植株体内变化趋势相似，即病毒进入植株体内，随着时间的推移病毒含量逐渐增加，达到发病高峰期，随后病毒含量开始降低。但3 个分离物在侵入植株体内的初始时间、发病速度、发病高峰期的病毒含量方面具有一定的差异（表1）。

表1 不同PVA 分离物植株体内病毒含量的变化（copies/μL）Table 1 Changes of virus contents in plants inoculated with different PVA isolates

分离物2017-171 接种后的第2 d qRT-PCR 检测结果为阳性，表明该分离物可以在接种后第2 d成功侵染‘克新13号’，其病毒在体内含量为1.67×101copies/μL，随着时间的推移，植株体内病毒含量逐渐升高，第20 d 时达到最高值3.90 × 107copies/μL，随后病毒含量又呈降低趋势；分离物KB117接种后的第2 d开始侵染‘克新13号’，在第2～5 d 病毒含量累积缓慢，随后病毒含量大幅度升高，第15 d 时达到发病高峰期，植株体内病毒含量达最高值1.77 × 106copies/μL，随后呈降低趋势；分离物2017-176 接种后的第2 d 未能侵染‘克新13 号’，在第5 d 时才呈现病毒含量有所升高趋势，随后病毒含量大幅度升高，第15 d 时达到发病高峰期，植株体内病毒含量达最高值1.29×107copies/μL，随后病毒含量呈降低趋势，表明此分离物侵染植株相对较慢。

由以上分析可知，分离物2017-171 和KB117均在接种后第2 d 开始侵入植株体内，而2017-176 侵染速度相对较慢；2017-171 在接种后第20 d 病毒含量达到高峰，而2017-176 和KB117 在第5～10 d 病毒含量大幅度升高，都在15 d 时植株体内病毒含量达到高峰，但KB117 的高峰含量低于2017-171 及2017-176。

2.2.2 PVA 不同分离物侵染‘克新13 号’植株症状差异

分别在接种后达到发病高峰期时观察植株发病症状。与对照相比，分离物2017-171 接种‘克新13 号’后呈现轻花叶、叶缘微皱缩等症状；分离物KB117 接种‘克新13 号’后会出现叶缘变尖、波浪状皱缩等症状；分离物2017-176 接种后，症状不明显，仅个别叶片呈现轻微叶缘皱缩等症状（图2）。不同分离物接种‘克新13 号’的植株症状表现存在差异，说明3 个分离物致病力有一定差别，但对植株整体长势影响不大。

图2 不同PVA 分离物接种‘克新13 号’植株症状Figure 2 Symptoms of 'Kexin 13' inoculated with different PVA isolates

2.2.3 PVA 不同分离物侵染‘克新13 号’块茎症状差异

从各分离物接种后的单株块茎个数和块茎症状可以看出（图3），与对照相比，整体趋势为，单株块茎数减少、块茎变小、芽眼变深，个别块茎出现变形等症状。其中典型的块茎症状与对照相比较，分离物2017-171 接种后块茎出现裂口、芽眼变深症状；分离物KB117 接种后块茎出现畸形症状、芽眼变深症状；分离物2017-176接种后块茎仅出现芽眼变深症状。

图3 不同PVA 分离物接种‘克新13 号’块茎症状Figure 3 Symptoms of tubers of 'Kexin 13' inoculated with different PVA isolates

3 讨 论

PVA 的寄主范围相对较窄，主要以侵染茄科等植物为主，如马铃薯、番茄、洋酸浆、假酸浆、烟草等[16]。其侵染症状于1914年首次被报道[17]，并于1932 年正式命名[18]。PVA 主要通过种薯传播和摩擦接触传播，还可以通过蚜虫以非持久性方式传播。随着马铃薯种植面积的不断扩大以及各地种薯调运而在世界范围内传播。在中国，于1975年首次在黑龙江省克山县发现此病毒[19]，而后几乎遍布于马铃薯的各主要产区[20]。

PVA 侵染马铃薯时，其症状类型，与马铃薯品种、病毒株系、环境条件等具有一定相关性[21-23]，抗性较强品种，一般不表现症状，而致病性相对较强株系可以导致马铃薯敏感品种产生花叶、斑驳、皱缩等较严重症状。

范国权等[24]将马铃薯9 种病毒接种在黑龙江省10 个马铃薯主栽品种上，当PVA 和PVY 复合侵染品种‘克新13 号’时，植株症状较其他品种明显，且产量影响显著。魏旭言[25]将具有较强致病性的PVA 分离物接种在10 个马铃薯主栽品种上，有5 个品种接种成功，其中‘克新13 号’和‘丽薯6 号’接种后植株及块茎致病症状较明显，测定发病高峰期PVA 病毒含量，结果为‘克新13 号’表现最高，说明PVA 对此品种危害性最强。

不同PVA 分离物在同一马铃薯品种上引起的致病症状也不相同。Valkonen 等[26]将PVA 接种到马铃薯品种‘King Edward’上，根据侵染症状不同将PVA 分离物分成了3 组，分别为植株上部叶片典型性坏死、叶片斑驳和无感染症状3 种类型，之后Rajamäki 等[22]研究又增加了一组，该株系可引起‘King Edward’全株叶片发黄、植株矮化。同时Rajamäki 等[22]将来源于不同国家的18 个PVA分离物CP 序列进行系统发育分析，发现其序列差异显著，存在明显多样性。

本研究将3 种PVA 分离物分别接种在指示植物‘黄花烟’和马铃薯品种‘克新13 号’上，通过qRT-PCR 检测，结果均为阳性，其中分离物2017-171 症状最明显，导致‘黄花烟’叶片皱缩、泡斑和叶缘变形等症状，马铃薯植株叶片出现叶缘皱缩并伴有轻花叶症状，块茎出现严重裂口、芽眼变深症状；KB117 次之，可使‘黄花烟’叶缘微皱缩并伴有明脉症状，马铃薯植株叶缘变尖、波浪状皱缩，块茎发生畸形且芽眼变深；2017-176 症状相对不明显，‘黄花烟’仅叶片微皱缩、点状轻花叶，马铃薯植株仅个别叶片呈现轻微叶缘皱缩，块茎未出现畸形只存在芽眼变深症状。同时进行qRT-PCR 表达模式分析，发现2017-171 在马铃薯体内病毒含量最高，其次为2017-176 和 KB117。综上分析看出，3 种 PVA 分离物均可以成功侵染指示植物‘黄花烟’和马铃薯植株，且分离物2017-171 致病力最强，不仅在植株体内含量最高，还能导致马铃薯块茎畸形并产生裂口现象。PVA 不同株系的致病性分析为其有效防治提供了有价值的理论依据。