核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在子宫内膜癌组织中的表达及与患者临床特征和预后的关系△

尹保娜，薛文玲，毛晓红，李瑞敏，安芳，张莉，吕小红，李玉静

焦作市妇幼保健院妇瘤科，河南 焦作 454000

子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，中晚期子宫内膜癌因缺乏有效的综合治疗方法，整体治疗效果不佳，因此，寻找有效的早期诊断和治疗子宫内膜癌的分子标志物有重要意义。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRC3）作为在肿瘤发生发展过程中的关键分子，低表达是结直肠癌发生发展的危险因素，但关于NLRC3在子宫内膜癌中的表达及作用机制的相关报道较少。本研究检测NLRC3在子宫内膜癌中的表达，分析其及与患者临床特征和预后的关系，为子宫内膜癌的诊断及分子免疫治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2015年10月在焦作市妇幼保健院接受手术治疗且术后病理学检查证实为子宫内膜癌的患者。纳入标准：①病历资料真实完整；②术后病理学检查证实为子宫内膜癌；③术前未接受相关抗肿瘤治疗；④无严重内分泌、免疫及代谢疾病，无其他严重合并症。排除标准：合并其他恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入45例子宫内膜癌患者，﹤55岁18例，≥55岁27例；未绝经11例，绝经34例；肌层浸润深度：≤1/2 36例，﹥1/2 9例；有淋巴结转移1例，无淋巴结转移44例；组织学分级：G级12例，G级33例；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期6例；远处转移1例，无远处转移44例。同期选取48例因子宫良性病变（子宫肌瘤23例、异常子宫出血25例）行子宫切除术的患者。

1.2 免疫组化法检测NLRC 3的表达情况

取45例子宫内膜癌患者的子宫内膜癌组织及48例子宫良性病变患者的正常子宫内膜组织，4%中性甲醛固定，石蜡包埋，3 μm连续切片，苏木素-伊红染色，60℃烤箱烘片4 h，然后脱蜡至梯度酒精水化。采用柠檬酸抗原修复液煮沸2 min进行抗原修复，动物血清封闭、孵育一抗（稀释浓度为1∶200）、孵育二抗，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，封片。结果判定：NLRC3主要定位于细胞质，细胞质出现棕黄色颗粒即为阳性，依据染色强度和阳性细胞所占比例进行评分。依据染色强度评分：无染色计0分，浅黄色染色计1分，棕黄色染色计2分，棕褐色染色计3分。依据阳性细胞所占比例评分：阳性细胞所占比例﹤25%计1分，≥25%且﹤50%计2分，≥50%且﹤75%计3分，75%～100%计4分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相加，1～3分为阴性、4～5分为弱阳性、6～7分为强阳性。同时，采用Image J软件测算NLRC3在各子宫内膜组织图片中NLRC3蛋白表达的平均光密度值，即为NLRC3蛋白的相对表达量。

1.3 随访

通过电话及门诊复查的方式进行随访，随访时间为患者手术当日至2020年10月，随访终点为患者死亡或达到随访截止时间，记录生存情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NLRC 3蛋白表达情况的比较

48例正常子宫内膜组织中，NLRC3强阳性表达30例、弱阳性表达10例、阴性表达8例，阳性表达率为83.33%（40/48）；45例子宫内膜癌组织中，NLRC3强阳性表达5例、弱阳性表达6例、阴性表达34例，阳性表达率为24.44%（11/45）；子宫内膜癌组织中NLRC3蛋白的阳性表达率明显低于正常子宫内膜组织，差异有统计学意义（χ=32.52，P﹤0.01）。通过Image J软件分别计算每张图片中NLRC3的平均光密度值，结果显示，子宫内膜癌组织中NLRC3的平均光密度值为（159.72±10.32），明显低于正常子宫内膜组织的（171.83±10.21），差异有统计学意义（t=5.586，P﹤0.01）。（图1）

图1 NLRC 3在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中的表达情况（免疫组化染色，×200）

2.2 不同临床特征子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中NLRC 3表达情况的比较

不同年龄、绝经情况子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中NLRC3平均光密度值和阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。组织学分级为G级、肌层浸润深度≥1/2、有淋巴结转移、有远处转移、FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中NLRC3的平均光密度值分别低于组织学分级为G级、肌层浸润深度﹤1/2、无淋巴结转移、无远处转移、FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（t=3.75、4.75、6.87、7.54、5.87，P﹤0.05）。组织学分级为G级、肌层浸润深度≥1/2、有淋巴结转移、有远处转移、FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中NLRC3阳性表达率分别低于组织学分级为G级、肌层浸润深度﹤1/2、无淋巴结转移、无远处转移、FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（χ=10.18、10.86、10.45、10.83、2.24，P﹤0.05）。（表1）

表1 不同临床特征子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中NLRC 3表达情况的比较（n=45）

2.3 NLRC 3表达水平对子宫内膜癌的诊断价值

ROC曲线结果显示，NLRC3水平诊断子宫内膜癌的AUC为0.865，此时的灵敏度为83.3%、特异度为78.4%、阳性预测值为87.4%、阴性预测值为82.4%，约登指数为161。（图2）

图2 NLRC 3平均光密度值诊断子宫内膜癌的ROC曲线

2.4 不同NLRC 3表达情况子宫内膜癌患者预后的比较

以ROC曲线中NLRC3平均光密度值诊断子宫内膜癌的阈值161为分界，将子宫内膜癌患者分为NLRC3低表达组（n=32，NLRC3平均光密度值≤161）和高表达组（n=13，NLRC3平均光密度值﹥161），绘制 Kaplan-Meier曲线，结果显示，NLRC3高表达组子宫内膜癌患者5年生存率为92.31%（12/13），与低表达组患者的93.75%（30/32）比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）；NLRC3高表达组子宫内膜癌患者平均生存时间为（75.24±3.54）个月，与NLRC3低表达组患者的（77.03±2.31）个月比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。（图3）

图3 NLRC 3低表达组（n=32）和高表达组（n=13）子宫内膜癌患者的生存曲线

3 讨论

子宫内膜癌的发病率仅次于宫颈癌，居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位。近年来，虽然子宫内膜癌的诊断及治疗均取得了一定进展，但因缺乏更有效的治疗方案，患者的5年总生存率仍然较低。

作为免疫系统的重要组成部分，模式识别受体与肿瘤发生发展密切相关。其中核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NOD-like receptor，NLR）在与内外源性病原引起的或损伤相关分子模式引起的免疫和炎症反应中发挥一定作用。根据生物学功能的不同，NLR可分为形成炎性小体NLR和非形成炎性小体NLR。其中NLRC3属于非形成炎性小体，是由第16号染色体基因编码的胞质内模式识别受体，是一个庞大的调节免疫功能和其他细胞功能的NLR蛋白家族的成员。

作为细胞内三大主要信号转导通路之一，磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy ki-nase，PI3K）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路在细胞生长、分化、凋亡等方面均发挥着重要作用，对肿瘤发生发展发挥促进作用，通常在肿瘤发生发展的早期即开始启动。NLRC3对PI3K/MTOR通路有一定的抑制作用，扮演“刹车”角色，该通路下游的MTOR是关键激酶，在调节肿瘤细胞的存活、生长、增殖和血管生成等生物学作用中发挥关键作用，被认为是肿瘤复发和转移的重要因素。而NLRC3通过阻断PI3K/MTOR信号通路，可抑制肿瘤的发生、发展、复发及淋巴结转移等过程，有利于改善预后。

本研究结果显示，子宫内膜癌组织中NLRC3的平均光密度值明显低于正常子宫内膜组织，提示在子宫内膜细胞增殖的过程中，NLRC3可能发挥抑癌基因的功能，Ma等通过小干扰RNA技术敲低NLRC3的表达，结果显示，与对照组细胞相比，人肝癌细胞HepG2和Hep3B的增殖能力均明显增强。提示NLRC3的正常表达对维持肝细胞稳态增殖从而防止肿瘤发生有重要作用。本研究结果显示，NLRC3在有淋巴结转移、肌层浸润深度﹥1/2、组织学分级为G级、有远处转移、FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期的子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中的表达水平较低，提示NLRC3低表达可能加速了子宫内膜癌细胞对周围组织的浸润、淋巴结转移和远处转移，其可能通过靶向调节PI3K/MTOR信号通路发挥抑制肿瘤细胞增殖、转移的作用。

此外，本研究对NLRC3表达与子宫内膜癌患者预后的关系进行分析，结果显示，NLRC3高表达与低表达子宫内膜癌患者的术后5年总生存率无明显差异，但本研究为样本量较小的回顾性研究，且纳入患者的FIGO分期以Ⅰ～Ⅱ期居多，本身就具有较高的5年生存率，一定程度上可导致患者的5年生存率无明显差异，因此，本研究的结论尚需更多的前瞻性研究证实。Ma等为进一步推测NLRC3与肿瘤患者生存、预后的关系，对肝细胞癌患者进行研究后发现，NLRC3高表达患者和低表达患者的5年生存率分别为60.7%和32.8%，表明NLRC3低表达患者的预后较差。已有研究证实，肿瘤的分期与患者的预后密切相关，随着肿瘤分期的增加，NLRC3的表达水平逐渐降低，分期越晚则患者的预后越差，NLRC3的表达水平与肿瘤的分期相关，因此可以推测NLRC3的表达水平与患者的预后直接相关。近年来，随着液体活检技术的推广及发展，有望仅通过检测血液NLRC3的表达水平来对子宫内膜癌患者的预后进行预测，使分子免疫治疗子宫内膜癌成为可能。

本研究结果显示，NLRC3表达水平达到阈值（平均光密度值为161）时，AUC较高，为0.865，提示NLRC3水平可为子宫内膜癌的诊断提供参考，且其诊断的灵敏度和特异度均较好（灵敏度为83.3%、特异度为78.4%）。但本研究纳入的样本量较小，后期尚需更多的大样本研究来进一步验证。

综上所述，NLRC3在子宫内膜癌组织中呈低表达，且其低表达预示着患者发生肌层浸润、淋巴结转移和远处转移的可能性较大，提示NLRC3低表达在一定程度上加速了子宫内膜癌形成和恶性进展。虽然本研究结论未提示5年生存率间的差异，但也提示NLRC3可能作为子宫内膜癌患者预后评估的潜在标志物。本研究为非随机单中心的回顾性研究，研究本身存在各种局限，且纳入的样本量较小，因此，NLRC3与子宫内膜癌间的关系还需要大样本随机对照研究来进一步证实。