矮牵牛F3’5’H 基因在花瓣呈色中的作用解析

符真珠，王 锐，张泰然，王慧娟，高 杰，李艳敏，蒋 卉，王利民，袁 欣，李彦邦，张和臣

（1. 河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002；2. 上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240）

矮牵牛是一类应用非常广泛的花镜、花坛及家庭园艺植物。其花色非常丰富，具有白色、红色、粉色、紫色、蓝色、复色以及黄色等多种类型[1-4]。研究表明，决定矮牵牛花色的主要物质是花青苷，主要包含天竺葵、矢车菊和飞燕草等色苷类型，它们分别由F3H、F3’H、F3’5’H等基因控制[5-6]。蓝色是一种稀有色，主要有飞燕草素控制，其花卉种类较少。F3’5’H是合成飞燕草素的主效基因，是细胞色素P450家族重要成员，该基因的转化应用是获得蓝色花种质的关键[7-9]。近几年,随着分子生物学的发展，月季、康乃馨、菊花等一些重要切花的蓝色花种质遗传改良已经获得突破，一些转基因品种在日本、澳大利亚等已经得到了商业化推广应用[10]。如在康乃馨中共表达矮牵牛细胞色素b5和F3’5’H基因，可以使转基因后代株系的飞燕草素苷含量明显增加[6]。在切花月季中导入三色堇F3’5’H和鸢尾DFR基因，并同时抑制其内源DFR基因的表达，成功创建了呈现蓝色花瓣的月季种质[5]。抑制菊花内源F3’H，并导入三色堇F3’5’H基因，也成功获得了蓝色花转基因株系[11]。矮牵牛中花青素苷合成相关结构基因已经被解析，在Petunia inflata、P.axillaris基因组中F3’5’H基因由2 个基因座编码，分别是HF1和HF2[12]。本研究对矮牵牛不同基因型的F3’5’H进行了鉴定和功能分析，以期为后续花色分子育种奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

矮牵牛材料P. inflata、P. axillaris、P. exserta以及P.hybridaM1（简写为M1，下同）、P.hybridaV30（V30）、P.hybridaR27（R27）等均由荷兰Ronald Koes教授实验室赠送，为了便于遗传转化和性状分析，对一些矮牵牛进行了杂交，分别为M1×R27（粉色）、M1×V30（紫色）、P.axillaris×R27（紫色）及自交后代F2（白色、粉色、红色或粉紫色）。矮牵牛植株在光照强度8 000～10 000 lx、光周期16 h 光照/8 h 黑暗、温度25～30 ℃、相对湿度50%左右的条件下培养。

1.2 F3’5’H基因鉴定及克隆

矮牵牛F3’5’H基因序列在基因组网站中（https://solgenomics.net/tools/blast/）通过Blast分析获得，并将获得的DNA 序列进行内含子/外显子分析。各个品种（种）或转基因后代的矮牵牛DNA 提取采用2×CTAB 方法；RNA 提取采用Trizol 试剂盒并通过NanoDrop 2000 进行质量检测，反转录采用PrimeScript™Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行。F3’5’H基 因 克 隆 采 用 高 保 真Taq酶 试 剂 盒PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase[宝日医生物技术（北京）有限公司]，所用引物（5′—3′，下同）如下，HF1-Fw：ATGCTACTTACTGAACTTGCTGC，HF1-Rv：CTATGGTACATAAACATCAAATTG，HF2-Fw：ATGGTGCTACTTAGTGAGCTTG，HF2-Rv：CAAGCTAAAGGTGCATAAACATC。不同矮牵牛HF1和HF2位点编码基因的基因型分型所用引物为，HF1（F3’5’H1）-Fw：GCTTGGATGGATTTACAAGGGATAG，HF1（F3’5’H1）-Rv：CATAGCTTCAAGAGGGACAGC；HF2（F3’5’H2）-Fw：CTATAACTAACGGCCGGCGTC，HF2（F3’5’H2）-Rv：CTCTCCCCTTCTCTGCTCATATC。

1.3 F3’5’H基因序列比对及进化分析

进化树分析通过MEGA 6.0 软件进行，将获得的F3’5’H基因所编码的氨基酸序列进行比对，并通过Construct/Test maximum Likelihood Tree 程序建立进化树。所用其他植物的F3’5’H基因编码氨基酸序列根据GenBank 序列号在NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得。氨基酸序列比对采用DNAMAN软件进行。

1.4 F3’5’H及相关基因转录分析

以P. axillaris×R27 自交F2代的花瓣为材料，对F3’5’H及其上游调控基因AN2、PHZ、DPL、AN4（R2R3-MYB家族成员）的表达进行分析。所用相关引物如下，F3’5’H-Fw：GCTTGGATGGATTTACAAGGG，F3’5’H-Rv：TGGTTCGTTCGAGATCCTAGG（F3’5’H1和F3’5’H2通 用 引 物）；AN2-Fw：GAGGGGACTTCTCTTTGGATG，AN2-Rv：CGATGGTGCTGTTTCCTCATGCAA；PHZ-Fw：GGGACTTCTCTGAGGATGAAGTA，PHZ-Rv：ATCATTTTCGTTGCAGTTAGCTAG；DPL-Fw：GACTTTTGTCCGGAGGAAGTGGAC，DPL-Rv：GCATTCTTGGCCATGGTCCTAATTTC；AN4-Fw：GACTTCTCTCCAGATGAAGTGG,AN4-Rv：TTGAGAGGTTCCGAGGTTGAGG；actin-Fw：CTACGAGGGTTATGCTTTGCC，actin-Rv：GCTGGAATGTGCTAAGGGATG。

1.5 矮牵牛F3’5’H基因超表达载体构建及遗传转化

将克隆得到的矮牵牛F3’5’H基因采用gateway载体系统首先通过BP反应构建至pDNOR207载体，然后通过LR反应构建至超表达载体pK2GW7，并转化至农杆菌Agl1。载体构建所用引物序列如下，F3’5’H1-Fw：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCTACTTACTGAACTTGCTGC，F3’5’H1-Rv：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATGGTACATAAACATCAAATTG，F3’5’H2-Fw：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGTGCTACTTAGTGAGCTTG，F3’5’H2-Rv：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAAGCTAAAGGTGCATAAACATC。

矮牵牛遗传转化所用品种类型为M1×R27，采用叶盘转化法。首先将培养好的矮牵牛叶片在70%乙醇中消毒5 s，然后在0.5%次氯酸钠中消毒10～12 min，再用无菌水冲洗5 遍。将冲洗后的矮牵牛叶片切割成10 mm 左右的方块，在农杆菌中浸染10 min。浸染后的叶片在共培养培养基（MS+20 g/L蔗 糖+10 g/L 葡 萄 糖+0.1 mg/L 萘 乙 酸+1.0 mg/L 玉 米素+2.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤+8 g/L 琼脂粉，pH 值5.7）中培养2 d，然后转移至筛选培养基（共培养培养基+100 mg/L 卡那霉素+250 mg/L 头孢噻肟钠）中培养40～60 d，获得矮牵牛转化植株。将转化植株进一步转接到生根培养基（MS+20 g/L 蔗糖+10 g/L 葡萄糖+8 g/L 琼脂粉+100 mg/L 卡那霉素+250 mg/L 头孢，pH 值5.7）中培养30 d。将生根后的矮牵牛植株移栽到基质中培养至开花，进行表型和基因型分析。

1.6 矮牵牛花瓣色素含量测定

矮牵牛花瓣中花青素含量测定采用高效液相色谱法（HPLC）。分别采集对照矮牵牛M1×R27、M1×V30 及每个F3’5’H转基因后代中10 个矮牵牛花瓣（完全展开期）进行冻存备用，测定试验在苏州科铭生物技术有限公司进行。测定的花青素类型包括飞燕草素、矢车菊素、二氢槲皮素和二氢杨梅素。

2 结果与分析

2.1 矮牵牛F3’5’H基因型分析

通过Blast对矮牵牛基因组中F3’5’H基因分析表明，P.inflata共有HF1和HF2两个位点，其中HF1位点有1 个编码基因，命名为F3’5’H1inf，HF2位点有2个基因连锁在一起，分别命名为F3’5’H2-1inf和F3’5’H2-2inf。P. axillaris基因组也有HF1和HF2两个位点，但是HF2位点只包含1 个F3’5’H2axi基因。在编码区内这些F3’5’H基因都含有2 个内含子，其中第1 个内含子的插入位置相同，但是F3’5’H1axi（F3’5’H1-i）第2 个内含子序列比F3’5’H1inf（F3’5’H1-ii）长813 bp。同时，对矮牵牛P. exserta以及R27、V30（不同矮牵牛品种花瓣呈色表型见图1A）中的F3’5’H基因进行了克隆分析。结果表明，F3’5’H1R27编码区的DNA序列长达5 099 bp，在第3个外显子区域有1 个dTPH9转座子的插入（F3’5’H1-iii），而F3’5’H1V30可以正 常 编码。F3’5’H2与F3’5’H1基因结构和序列长度类似，都有2 个内含子插入，而且第1 个内含子的插入位置相同（图1B）。对基因型分析表明，在P.axillaris、P.exserta、R27 等矮牵牛中都含有1 个F3’5’H2成员，而在P.inflata中含有2 个成员，并且紧密连锁在一起。已有报道表明，F3’5’H1R27类型的基因在一些矮牵牛园艺品种中被检测到，说明存在该类型基因的矮牵牛种质参与了现代园艺品种的创制[13]。因此，根据F3’5’H基因内含子序列的长度差异设计引物，在不同矮牵牛中进行PCR 扩增，通过凝胶电泳可以定向检测F3’5’H在不同矮牵牛中的基因型（图1C）。F3’5’H基因型差异可为后续进行矮牵牛花色分子设计育种提供重要遗传依据。

2.2 矮牵牛F3’5’H序列及进化特性分析

对鉴定和克隆得到的F3’5’H基因所编码的氨基酸序列建立进化树，结果表明，矮牵牛的HF1位点与HF2位点所在的F3’5’H基因分布在一个分支单元，属于典型的CYP75A 基因家族类型，而F3’H属于CYP75B 型[14]。但是F3’5’H1和F3’5’H2基因在聚类上出现了明显的分离，它们各自聚类在一起（图2A），说明它们在矮牵牛物种分化之前就已经产生。对其编码的氨基酸序列比对分析表明，F3’5’H1inf、F3’5’H1axi以及F3’5’H2编码氨基酸数目相同，它们之间的序列相似性高达97.0%以上。F3’5’H1R27基因编码的氨基酸由于dTPH9转座子的作用，使正常编码的转录本多出了2 个氨基酸（图2B）。

2.3 F3’5’H基因的表达特性及对花瓣的呈色作用

为了检测矮牵牛F3’5’H基因对花瓣呈色的作用，对矮牵牛P. axillaris和R27 杂交获得的F2进行表型和基因型分析。由图3 可知，F2的花瓣呈色表型主要有4类，分别是白色花瓣黄色雄蕊、粉紫色花瓣紫色雄蕊、粉紫色花瓣黄色雄蕊以及红色花瓣黄色雄蕊（图3A 的L1、L3、L6、16）；占比较多的为粉紫色花瓣紫色雄蕊和粉紫色花瓣黄色雄蕊类型，这2种类型的后代中都含有能正常编码的F3’5’H1axi基因，说明该基因在紫色花瓣的形成中起着重要作用。对F2中（L1—L20）的F3’5’H1基因型进行分析（图3B），20株后代中，F3’5’H1R27基因型有16个（纯合型2 个），F3’5’H1axi基因型有13 个（纯合型3个）。对L2 和L17 两种类型后代中相关基因表达特性的分析结果表明，F3’5’H基因的表达，在花冠和花管中都是随着花瓣的发育（S2—S7，即花瓣露出花萼期至花瓣完全展开期）逐渐增强，而在雄蕊中的表达逐渐减弱（图3C）。F3’5’H基因在雌蕊中尽管也有表达，但是并没有呈现花青苷积累的表型。前期研究发现，F3’5’H1基因主要受AN2 和ASRs 等转录因子的特异性调控，而F3’5’H2主要受AN4 转录因子的调控[15]。说明F3’5’H对花瓣的呈色作用跟基因型关联密切，并受制于不同R2R3-MYB 基因成员的表达特性。

2.4 F3’5’H转基因功能分析

在矮牵牛M1×R27中，对F3’5’H基因的转录本测序表明，F3’5’H1R27具有可变剪切现象，其中1 条转录本可以正常编码，而另1 条转录本不能正常编码。因此，该品种的花瓣中积累以矢车菊素苷为主的花青苷类型，导致花瓣呈现粉色。为了验证不同F3’5’H基因型的分子功能，在矮牵牛M1×R27 中进行遗传转化（超表达）分析。结果表明，OE（Over expression）-F3’5’H1inf、OE-F3’5’H1axi、OEF3’5’H2-1inf以及OE-F3’5’H2-2inf都可以使转基因矮牵牛后代中的花瓣呈现明显的紫色变化趋势（图4A）。与对照M1×R27 相比，转基因后代的花瓣颜色明显加深，接近于M1×V30 的呈色表型；但是，OE-F3’5’H1R27却没有表现出明显的呈色变化，说明该基因编码的氨基酸不能促使底物向飞燕草素方向有效转化。

对矮牵牛转基因植株和对照M1×R27花瓣花青素成分的HPLC 分析表明（图4B），M1×R27 对照只有4.03 mg/kg 的飞燕草素，说明该品种中的F3’5’H编码蛋白具有一定的活性，但是较弱，进一步验证了F3’5’H1R27的可变剪切事件。转基因矮牵牛花瓣中的色素含量，除了OE-F3’5’H1R27之外，其他转基因植株中的飞燕草素含量明显增加（57.56～70.23 mg/kg），F3’5’H的直接反应产物二氢杨梅素也明显增加（129.58～152.64 mg/kg）；其竞争产物二氢槲皮素（13.52～20.00 mg/kg）和矢车菊素含量（9.01～21.22 mg/kg）却明显减少。说明F3’5’H基因对花青素合成方向的改变起到了重要作用，使花瓣呈色由粉色向紫色发生改变。

3 结论与讨论

花青苷成分与含量是决定花瓣呈色的化学基础[16-17]。其中飞燕草素类型是紫色和蓝色花瓣的主要色素类型。控制飞燕草素合成的一个主效基因是F3’5’H，其分子功能的有无和强弱直接决定花瓣中飞燕草素的含量[9，18-19]。矮牵牛是研究花瓣呈色的一种重要模式植物[1]，对其F3’5’H基因功能进行细化和系统研究可以揭示紫色、蓝色及粉色花瓣呈色的分子基础。本研究表明，在矮牵牛中存在HF1 和HF2 两个位点，分别编码不同的F3’5’H基因。说明该基因在矮牵牛的物种进化过程中非常活跃。本试验通过研究矮牵牛不同F3’5’H基因型、表达特性、转基因表型等，揭示了F3’5’H基因与矮牵牛花瓣呈色之间的关系，即粉色花瓣的呈色主要源于该基因的突变，不能正常编码行使酶功能；正常编码的F3’5’H基因可以促使合成飞燕草素，使花瓣呈现紫色。因此，F3’5’H基因能否正常编码是矮牵牛花瓣呈色差异化的重要分子基础之一。该基因的转录直接受AN2、ASRs、DPL 等转录因子的调控，不同转录因子调控不同的F3’5’H基因型，F3’5’H1基因主要与花瓣中花冠的呈色直接相关，而F3’5’H2基因主要与雄蕊、雌蕊、花管等呈色相关[7]。F3’5’H基因型差异可以作为今后矮牵牛分子设计育种的一个关键位点，通过父母本基因型的标记检测，一定程度上可预测杂交后代的花色性状分离特性。

在花青苷合成基因中，F3H、F3’H和F3’5’H是决定花青苷合成类型的3 个关键基因，它们分别控制天竺葵素、矢车菊素和飞燕草素。其中F3’H和F3’5’H是细胞色素P450家族成员，不同植物中，它们的成员数量、进化特性、表达方式具有很大差异，这些分子特性都是控制下游花青苷差异化的基础[20]。在矮牵牛中，3 个类型的基因都存在，但是AN2、ASRs、AN4等基因主要控制F3H和F3’5’H的表达，而F3’H基因的表达特性并不受R2R3-MYB转录因子的影响[21-22]。这些结果表明，一方面，矮牵牛花瓣中花青苷类型的积累主要受F3’5’H基因的影响（基因型和表达特性），另一方面，虽然F3H基因的表达也同步受到调控，但是矮牵牛中的DFR（二氢山奈酚4-还原酶）活性可能对二氢杨梅素具有偏好性，更能促使飞燕草素类的合成[23]。本研究揭示了矮牵牛花瓣呈色的一种重要分子机制，也为今后研究其他植物的花瓣呈色机制提供了重要线索。