纳米SiO2对霍山石斛生长的影响

刘 鑫,王天鑫,卢一泓，樊洪泓

安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥,230036

目前，随着纳米材料的大量使用[1-3]，纳米材料已不可避免地进入环境当中。在纳米材料的工业化生产和使用之初，便有学者认识到其可能存在的环境风险[4]，并对其环境行为、生物毒性、生态毒理等开展了一系列的研究[5-6]。

纳米材料通常是指至少一维处于纳米尺度(1～100 nm)上的材料，或由它们作为基本单元构成的材料[7]。除去纳米尺寸效应外，纳米材料对植物生长的影响，主要取决于纳米材料的元素组成及植物物种的不同，同时纳米材料的物理参数，如纳米材料的粒径、比表面积、浓度、形态等,外界条件，如温度、所处的相、压力等,施用方式，如叶面喷施[8]、水培[9]、浸种[10]、琼脂培养[11]等，均对纳米材料的生物学效应产生一定影响[12]。

纳米材料通常在一定条件下宏观上促进植物的生长[13]，使其叶绿素含量增加[14]、种子萌发活力升高[15]、根茎生长[16]等；偏离一定条件(纳米材料的选择、外界条件的设置、施用方式的实施等)都将不利于植物的生命活动，具体表现为整体氧化水平升高、叶片黄化[17]、种子及幼苗萌发率降低[18]等，但并没有较好的指标用于评价纳米材料对植物形态生长的影响。

目前的研究主要集中于纳米材料对粮食及蔬菜作物生长的影响[19]，较少见对药用植物生长的影响。霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)为兰科珍稀药用植物，生长缓慢且野生资源匮乏。本研究将生产中使用较多的纳米SiO2加入培养基质中，研究其对霍山石斛形态生长、抗氧化酶活性和叶绿素含量的影响，以期为霍山石斛栽培环境及资源保护提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

霍山石斛组培苗取自安徽农业大学植物组织培养室，选取生长状况与长势相近的幼苗用于试验处理。

1.2 试 剂

纳米SiO2(15±5 nm)购自上海麦克林生化科技有限公司；总超氧化物歧化酶(T-SOD)比色法测试盒(羟胺法)、过氧化物酶(CAT)比色法测试盒，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；愈创木酚、过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 培养基和培养条件

继代培养基以MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+0.8%琼脂+3%蔗糖为基础，生根培养基以MS+0.2 mg·L-16-BA+2 mg·L-1NAA+0.8%琼脂+3%蔗糖为基础，加入不同的纳米材料处理，实验处理如下：

T1：90 mg·L-1纳米SiO2(15±5 nm)。

T2：60 mg·L-1纳米SiO2(15±5 nm)。

T3：30 mg·L-1纳米SiO2(15±5 nm)。

CK不加任何纳米材料。

培养条件为(25 ± 2)℃，光照时间为12 h·d-1，光照强度20～30 μmol·m-2·s-1。

1.4 霍山石斛生长状况记录

培养3～5个月后，在无菌条件下，将4株霍山石斛幼苗规则排列于培养皿中，并置于网格纸上，拍照记录。8个月后收获幼苗，选取10～15株的霍山石斛全草、叶片、茎进行拍照记录。

1.5 生理生化指标测定

取1 g霍山石斛茎于研钵中，加入磷酸缓冲液研磨为匀浆，离心后取上清即为粗酶液。采用愈创木酚显色法测定过氧化物酶(POD)活性[20]。总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化物酶(CAT)活性采用1.2所述试剂盒进行测定。取0.2 g霍山石斛新鲜叶片，使用乙醇提取法测定叶绿素含量。各指标每个处理取三个重复。

1.6 统计分析

采用Excel软件录入数据并计算，采用SPSS 19.0 软件对所得数据进行单因素方差分析，采用Duncan 法在p=0.05水平进行差异显著性检验。

2 结 论

2.1 不同浓度纳米SiO2对霍山石斛生长的影响

对不同浓度纳米SiO2处理组的生长状况进行比较(图1),看出对照组的生长状况要好于处理组，处理组间除了某些显著高的个体外，长势相似。生根培养后收获(图2)发现，除了对照的株型似乎更为规整、株高较高外，各组处理组间在生根、株型、鳞茎尺寸、叶形等方面均未观察到显著的差异。统计各组株高的数据(图3)，在移栽后3个月、4个月、5个月及8个月，对照组的株高都显著高于处理组。培养3个月，T2组株高显著高于T1、高于T3，但未达到显著水平。培养4个月、5个月及8个月，各处理组间株高都没有显著差异，且其差距不断缩小。

图1 不同浓度纳米SiO2在继代培养基中对霍山石斛生长形态的影响

图2 不同浓度纳米SiO2在生根培养基中对霍山石斛生长形态的影响

图3 不同浓度纳米SiO2对霍山石斛株高的影响

2.2 不同浓度纳米SiO2对霍山石斛抗氧化酶活性和叶绿素含量的影响

生长8个月时测定霍山石斛的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性及叶绿素含量(见图4)。由图4可知，随着处理组纳米SiO2浓度的降低，T-SOD、POD活性总体呈上升趋势。其中T3组的T-SOD活性略高于对照组，但未达到显著水平，而其他两组则显著低于对照组。各处理组POD水平均高于对照组，且都达到显著水平，并且在低浓度纳米SiO2处理中上升最为明显，与T1、T2差异显著。各组CAT水平中，仅T1与T2处理组间存在显著差异，其余各组CAT活性差异不显著，其中T1与T3略高于对照组，而中等浓度较大粒径的T2组则低于对照组。总叶绿素含量方面，各组均低于对照组，且仅T3组与CK之间存在显著差异，T3组的叶绿素a、b含量均低于其他处理组(图5)。T2组的叶绿素a水平高于T1、T3，与T3差异显著。而T1的叶绿素b含量高于T2、T3，其中显著高于T3。

图4 不同浓度纳米SiO2对霍山石斛茎中抗氧化酶活性的影响

图5 不同浓度纳米SiO2对霍山石斛叶绿素含量的影响

3 讨 论

本文结果表明纳米材料对霍山石斛直接作用的毒性效应，与其他在粮食及经济作物中得到的结果类似[21-23]。对形态的观察表明，各处理组株高水平均显著低于对照组，表明添加纳米SiO2对霍山石斛构成了逆境胁迫，而各个浓度梯度之间株型、鳞茎尺寸、叶片形状与叶面积都没有显著的差异，表明该浓度梯度内，纳米SiO2对霍山石斛形态并没有太大影响，这可能是实验所设置的浓度梯度尚不足以显示其差异，仍须进一步研究。对其生理生化指标测定的结果表明，随着处理纳米SiO2浓度升高，T-SOD、POD活性基本呈下降趋势，其中最低浓度纳米SiO2处理组T3的T-SOD活性略高于对照组，但未达到显著水平，而其他两组则显著低于对照组，可见高浓度的纳米SiO2处理使T-SOD水平降低，对植株的破坏作用已经超出了植物抗氧化还原系统的清除能力。低浓度纳米SiO2在对生长抑制作用较小的情况下，提升了抗氧化酶的活性，使得其抗逆性得到了一定提高，但其叶绿素含量显著减少，可能并不能促进其整体生长水平的提高及生物量的积累；而高浓度的纳米SiO2也具有较强的生长抑制作用，使其植株较矮，且SOD活性与CAT活性不匹配，代谢表现较为紊乱；中等浓度的纳米SiO2在没有引起叶绿素含量显著减少的情况下，部分提升了抗氧化酶活性，可能具有应用价值。本实验初步探究了不同浓度纳米SiO2对霍山石斛生长形态和抗氧化酶活性、叶绿素含量的影响，对于其非酶系统抗氧化活性成分及次生代谢的影响方面则尚待进一步探究。