糖尿病视网膜病变患者全视网膜光凝后角膜上皮基底神经丛和朗格汉斯细胞的改变及其相关性

刘刚 王效武 杨纪忠 郑晓汾 韩玉萍 赵炬伟 侯广平 于花

作者单位：山西省眼科医院，太原 030002

糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病在眼部最严重的并发症，可导致不可逆的视力损害，是工作人群（20～65岁）致盲的主要原因[1]。全视网膜光凝（Panretinal photocoagulation，PRP）是目前公认的可以有效阻止DR进展的治疗方法；但是，作为一种破坏性的治疗手段，PRP在发挥作用的同时也会对眼内组织的正常结构和功能造成一定的影响[2]。有研究认为，PRP是2型糖尿病患者眼表异常的高危因素[3]，可以导致角膜知觉减退和泪膜稳定性下降，并且可以加重患者的角膜神经损伤[4]。目前，PRP导致角膜神经损伤的确切机制还没有阐明；多数学者认为可能与睫状后长神经的热损伤有关[5]。近年来，免疫机制在角膜神经损伤中的作用日益受到重视。有研究指出，糖尿病患者角膜上皮基底神经密度下降与朗格汉斯细胞（Langerhans cell，LC）密度增加有关[6]；并且糖尿病动物模型研究也表明，LC和角膜上皮基底神经的直接接触可能是糖尿病角膜神经损伤的触发因素[7]。因此，本研究利用角膜共焦显微镜（Corneal confocal microscopy，CCM）观察了PRP治疗前后LC的变化，并分析其与角膜上皮基底神经（Subbasal nerve plexus，SNP）变化之间的关系，初步探讨免疫机制在PRP导致的角膜神经损伤中的作用。

1 对象与方法

1.1 对象

纳入标准：①年龄50～65岁；②经内分泌科确诊为2型糖尿病，且病程10～15年；③糖化血红蛋白6.5%～7.0%；④标准对数视力表单眼视力＞0.1；⑤眼压正常；⑥眼表无明显炎症表现，角膜光滑、透明；⑦同意接受检查并能按时完成随访者。排除标准：①瞳孔过小或玻璃体积血无法完成PRP者；②合并黄斑水肿或新生血管性青光眼；③合并其他眼底血管性疾病或先天异常；④眼外伤、眼部手术及激光治疗史；⑤干眼、角膜斑翳、翼状胬肉、圆锥角膜、高度近视、过敏性结膜炎、感染性角结膜炎、葡萄膜炎、青光眼病史或眼部持续用药史；⑥角膜接触镜配戴史；⑦除糖尿病以外的其他影响神经功能的系统性疾病和相关治疗史；⑧Ⅰ型糖尿病或其他特殊类型的糖尿病；⑨糖尿病合并酮症酸中毒或高渗综合征；⑩结缔组织病；⑪慢性肝脏或肾脏疾病；⑫PRP或随访期间接受抗血管内皮生长因子（VEGF）药物或内眼手术治疗者：⑬随访期间需要补充激光治疗者。

选取2019年4 ─11月就诊于山西省眼科医院激光室，经眼底荧光血管造影确诊为双眼糖尿病视网膜病变Ⅳ期的2型糖尿病患者。本研究经山西省眼科医院伦理委员会审核批准（伦理号：201804b），所有受检者对本研究目的和方法知情并自愿参加本研究。

1.2 方法

所有患者均选择病情较重眼为治疗眼，对侧眼为对照眼。分别于PRP治疗前、第1次光凝后1周、第2次光凝后1周、第3次光凝后1周、第4次光凝后1周和PRP完成后1个月行裂隙灯显微镜、眼压、眼底和CCM检查。按照先非接触性、后接触性检查的顺序进行。

1.2.1 一般眼科检查 入选患者常规行裂隙灯显微镜、非接触性眼压和眼底检查，排除眼表存在明显炎症，角膜存在瘢翳、新生血管、增生物和上皮缺损，虹膜红变以及前房炎症反应等；明确眼压是否正常，眼底是否符合DR Ⅳ期表现、激光后是否有玻璃体积血等并发症出现。

1.2.2 CCM检查与图像分析 采用海德堡Ⅱ代激光断层扫描系统（HRT-Ⅱ）（德国海德堡工程有限公司）的Rostock角膜模块完成。角膜接触帽与镜头之间的耦合剂使用卡波姆滴眼液（美国博士伦公司）。受检者采用0.2%丙美卡因滴眼液（美国爱尔康公司比利时分公司）表面麻醉。扫描深度定位到SNP层后，首先查找涡状结构，然后以这一结构为中心以“回”字型方式向外移动显微镜物镜扩展检查范围，使用“Section”模式快速采集涡状区及其周围2～3 mm范围的SNP图像。所得图像在Photoshop CC 2017图像处理软件（美国奥多比系统公司）中载入堆栈，将单张图像拼接合成局部形态图；再以涡状结构为中心裁剪700 μm×700 μm大小的图片，使用Image J图像分析系统（美国国家心理健康研究所）进行定量分析。使用Neuron J插件计算单位面积的神经纤维长度（Nerve fiber length，NFL）（mm/mm2）；使用Cell Counter功能分析成熟LC和未成熟LC密度。

1.2.3 PRP治疗 复方托吡卡胺滴眼液[参天制药（中国）有限公司]充分散瞳，0.2%丙美卡因滴眼液表面麻醉2次，由同一位经验丰富的激光治疗医师使用SupraScan 577多点扫描激光器（法国光太医疗公司）分4次完成标准PRP，每次间隔1周。光凝采用方形矩阵模式，周边视网膜因弧度变化导致聚焦困难或临近大血管处给予单点模式补充治疗。每期光斑数为600～800个，疗程结束时，光斑总数达到2 500～3 000个。激光参数设定为：光斑直径100～300 μm；功率100～200 mW；曝光时间0.05 s；光斑间隔1/2光斑直径；光凝强度达到Tso分级Ⅲ级轻～中度光斑反应。每次激光结束后均给予局部普拉洛芬滴眼液（山东海山药业有限公司）点眼4次/d，共1个月。

1.3 统计学方法

前瞻性临床研究。采用SPSS l8.0和SAS统计学软件进行数据分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验符合正态分布，以均数±标准差表示；计数资料用频数表示。观察组与对照组不同观察时间点LC密度和NFL值比较采用重复测量方差分析，多重比较采用Bonferroni检验。重复测量的NFL值和LC密度的相关性分析采用SAS软件的MIXED模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

共纳入符合条件的患者49例，其中男20例，女29例，年龄（55.1±4.3）岁。所有患者观察期内均无眼压升高、眼内炎症、活动性出血和补充激光。

2.1 PRP治疗后SNP改变

DR患者对照眼涡状区基线NFL值为（15.1±3.0）mm/mm2，治疗眼为（15.5±3.7）mm/mm2，二者比较差异无统计学意义（t=0.536，P=0.593）。接受PRP治疗后部分患者出现SNP神经纤维变细，伴有不同程度的涡状区神经结构缺失的神经损伤表现。治疗眼各观察时间点NFL值总体比较差异有统计学意义（F=8.039，P=0.004），其中，PRP治疗前与第2次光凝后1周、第3次光凝后1周和第4次光凝后1周NFL值比较差异均有统计学意义（P=0.018、0.012、0.007）；对照眼各观察时间点NFL值总体比较差异无统计学意义（F=0.136，P=0.929）。见表1。

2.2 PRP治疗后LC改变

DR患者对照眼基线LC密度为（46±53）cells/mm2，治疗眼为（40±54）cells/mm2，二者比较差异无统计学意义（t=0.511，P=0.611）。PRP治疗后有25例患者出现LC密度增加，主要表现为以涡状区为中心的聚集。其中6例患者在第1次激光后就出现LC密度增加；7例患者在第2次激光后出现LC密度增加；5例患者在第3次激光后出现LC密度增加；另外7例患者在第4次激光后出现LC密度增加。治疗眼各观察时间点LC密度总体比较差异有统计学意义（F=12.350，P＜0.001），其中，PRP治疗前与第3次光凝后1周、第4次光凝后1周以及PRP完成后1个月LC密度比较差异均有统计学意义（P=0.004、0.002、0.001）；而对照眼各观察时间点LC密度总体比较差异无统计学意义（F=1.624，P=0.169）。见表2。

PRP治疗开始后，治疗眼LC密度逐渐增加，且在第3次、第4次激光后涨幅最为明显，在PRP完成后1个月又开始出现回落。由此可见，LC密度与光凝次数存在明显的相关性，随着光凝次数的增加，LC密度逐渐增加。Pearson相关分析显示第4次激光后1周（即PRP完成后）LC密度与其基线水平呈正相关（r=0.674，P＜0.001）。

2.3 SNP改变与LC改变之间的相关性

在LC密度增加的患者中有3例出现大量LC活化，其浸润区SNP神经结构严重破坏（见图1）。相关分析也显示，重复测量的NFL值与LC密度呈负相关（-P=-0.041）。

3 讨论

正常角膜组织内不含血管和淋巴管，理论上具有免疫赦免特性。但是，角膜移植术后仍然有一部分患者会发生免疫排斥反应，其中一个重要的原因就是角膜上皮抗原提呈细胞——LC的存在[8]。LC属于髓源性树突状细胞，是眼表免疫系统中的专职抗原提呈细胞。生理状态下，LC主要分布于角膜上皮和上皮基底层[9]，其密度由角巩膜缘向角膜中央逐渐递减[10]。不仅密度降低，其不同部位的细胞状态也有差别。角膜中央的LC主要为未成熟细胞，而在角膜缘和周边角膜则存在少量的成熟细胞[11]。未成熟LC胞体较大，呈椭圆形或长形，抗原吞噬能力强但无抗原提呈功能，主要诱导免疫耐受；成熟的LC胞体变小，伸出细长的树突状结构，抗原吞噬能力减弱，但免疫诱导能力大大增强[12，13]。近年来随着对LC认识的不断深入，研究者们发现其在眼表疾病的发病机制中呈现双面性，即既能吞噬抗原导致免疫耐受，又可呈递抗原导致免疫反应，激活效应T细胞进一步放大炎性反应规模[14]。

正常情况下角膜内LC处于静止状态，当受到外界刺激（如微生物感染、异物、外伤、化学物质等）时，角膜细胞可释放白细胞介素-1和集落刺激因子等细胞因子，诱导LC聚集并活化[15，16]。Alzahrani等[17]研究指出，配戴角膜接触镜2 h角膜中央LC即可增加2倍，表明角膜接触镜可以诱发急性亚临床炎症反应。既往研究表明，通过CCM拍摄的LC已被基础和临床用于评估在体角膜的炎症水平，并得到广泛认可[18-20]；但是受观察视野小和定位功能差的限制，CCM在纵向研究中的应用备受质疑。本研究借鉴国外先进的拼图技术，有效克服了CCM检查设备的局限性。我们借助拼图观察了PRP治疗前后DR患者LC的变化，结果显示：在PRP治疗过程中，LC密度明显增加，并且出现以涡状区为中心的聚集，部分细胞甚至被激活而转化为成熟状态。并且随着光凝次数的增加，LC密度逐渐增加，在PRP治疗结束后又开始趋于稳定并缓慢下降，表明LC密度与光凝次数存在明显的相关性。推测其原因可能是PRP治疗作为一种刺激因素，其反复多次的激光辐射、接触镜所致的缺氧状态以及接触镜与角膜之间的摩擦都可能造成角膜上皮细胞的微损伤，导致炎症标志物表达增加，从而刺激LC向涡状区聚集和活化[17，21，22]。

表1.糖尿病视网膜病变患者接受全视网膜光凝治疗后治疗眼和对照眼各观察时间点神经纤维长度值（mm/mm2）比较Table 1.Comparison of the NFL value (mm/mm2) among each observation time point in the treatment eye and control eye after PRP treatment in DR patients

表2.糖尿病视网膜病变患者接受全视网膜光凝治疗后治疗眼和对照眼各观察时间点朗格汉斯细胞密度（cells/mm2）比较Table 2.Intra group comparison of the LC density (cells/mm2) among each observation time point in the treatment eye and the control eye after PRP treatment in DR patients

很多组织中都可以观察到树突状细胞与感觉神经纤维紧密接触[23-25]；在神经-肥大细胞共培养中还发现神经突与肥大细胞之间存在着形态学联系，其接触点还存在囊泡[26]，表明二者之间可能存在一定的相互作用。最近的一项研究表明，皮肤组织中约75%的树突状细胞紧密靠近或者直接与感觉神经接触，并且通过这种物理接触而相互作用。在角膜上皮基底层内，LC通常也位于SNP神经纤维周围[27]。Tavakoli等[6]通过CCM观察到糖尿病患者LC密度增加和神经纤维数量减少之间存在负相关关系。因此他们认为，免疫机制可能介导了糖尿病患者早期的角膜神经损伤。此后，Leppin等[7]通过对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型观察发现，高血糖导致角膜LC浸润，LC和SNP神经纤维的直接接触可能是糖尿病角膜神经损伤的触发因素。此外，Mandathara等[28]关于圆锥角膜的研究也认为，SNP神经纤维密度下降与LC增加有关。本研究也观察到PRP治疗后出现LC密度增加和SNP神经纤维长度下降，并且在成熟LC浸润区还出现SNP神经结构的缺失；进一步统计学分析显示重复测量的NFL值与LC密度呈负相关关系。这一结果与上述国外针对糖尿病和圆锥角膜患者的研究中角膜神经损伤与LC增加有关的结果一致，因此我们推测免疫机制也参与介导了PRP治疗后糖尿病患者的角膜神经损伤。但是，在De Cillà等[4]的研究中，PRP治疗后DR患者的角膜神经损伤增加了33%，而本研究中PRP治疗后1个月NFL值仅较治疗前轻度下降，表明PRP导致的角膜神经损伤还有其他因素的参与。

综上所述，本研究借助拼图技术观察了PRP治疗前后LC的变化，并分析了其与SNP变化之间的相关性。发现PRP多次光凝可以导致LC密度增加，并且成熟LC还可以导致SNP神经结构破坏，从而提出了免疫机制可能介导PRP治疗后SNP损伤的推断，从而丰富了PRP治疗后角膜神经损伤机制理论。当然，本研究仅仅是利用CCM从形态学方面分析了LC在PRP治疗后SNP损伤中的作用，并未进行相关组织学和免疫学指标的检测，其具体机制有待进一步体外研究的论证。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明刘刚：收集数据；撰写论文；对编辑部的修改意见进行修改。王效武、杨纪忠、郑晓汾、韩玉萍：参与选题、设计，资料的分析和解释。赵炬伟、侯广平：收集数据。于花：收集数据；参与选题、设计及资料的分析和解释，修改论文中关键性结果和结论，对编辑部的修改意见进行修改