饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊脾脏中Toll样受体2和白细胞介素-1受体相关激酶4表达的影响

王 霞 陈智丽 马焕交 李讨讨 刘 婷 马友记,3*

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070；2.新疆哈密市伊吾县林业和草原局，哈密839300；3.甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室，民勤733300)

近年来，随着依赖中草药为原料的大健康产业的迅猛发展，中药材生产及加工过程中产生了大量的非药用部位及副产物，造成极大的资源浪费和环境承载压力。研究发现，这些未被利用的副产物中多富含具有增强免疫力、抗菌消炎、助消化的可饲用资源性物质，可作为畜禽用药及饲料添加剂的原料加以利用[1]。黄芪为中医药常用药材之一，其有效成分主要包括黄芪多糖、黄芪黄酮和黄芪皂苷，在提高机体免疫力、抗菌、抗病毒和抗氧化等方面发挥重要作用[2]。已有研究表明，饲粮中添加黄芪能提高动物的生产性能和机体的免疫力，是一种理想的绿色饲料添加剂[3-4]。

脾脏是机体最大的免疫器官，在系统性免疫应答中发挥至关重要的作用。现代中医药研究结果表明，黄芪多糖可以激活Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)介导的髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖的信号通路来调节宿主的免疫应答反应[5]。TLR是免疫细胞中最上游的模式识别受体，可检测病原体相关的分子模式，启动信号转导。白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK)家族可介导TLR和白细胞介素-1受体(interleukin-1 receptor，IL-1R)的激活信号[6-7]。TLR2和IRAK4是TLR2/MyD88/核转录因子-κB(NF-κB)免疫信号通路上起着重要免疫调控作用的基因[8]。TLR家族内含有很多成员，目前在哺乳动物中至少鉴定到13个成员，TLR2是其中之一[9]。IRAK家族由4个成员组成：IRAK1、IRAK2、IRAK-M和IRAK4，这些家族成员在先天免疫、适应性免疫调节中具有重要作用[10]。然而，目前关于黄芪副产物对机体免疫机能影响的报道较少，为了探究饲粮中添加不同比例黄芪副产物对机体免疫机能的影响，本研究测定了绵羊的免疫器官指数，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot技术检测了绵羊脾脏组织中TLR2和IRAK4的mRNA和蛋白的相对表达量，并运用免疫组织化学染色技术检测了TLR2和IRAK4蛋白在绵羊脾脏中的定位，以期了解黄芪副产物在绵羊脾脏免疫调控中的作用，为进一步研究黄芪副产物对机体免疫调控的机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用黄芪副产物为制作黄芪饮片所产生的下脚料，购自某医药公司。黄芪副产物经风干粉碎过40目筛。以葡萄糖、芦丁、黄芪甲苷标准品制备标准曲线，利用比色法测得黄芪副产物中黄芪总多糖、总皂苷及总黄酮含量分别为13.94、0.82和1.35 mg/g。经测定，黄芪副产物营养水平见表1。

表1 黄芪副产物营养水平(干物质基础)

1.2 试验设计与饲养管理

试验选择体况良好、健康、体重[(27.43±3.61) kg]相近的3月龄澳洲白与湖羊杂交F1公羔68只，随机分为4组，每组17只羊。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加2%(2%组)、4%(4%组)、6%(6%组)的黄芪副产物。基础饲粮组成及营养水平见表2。饲养试验在甘肃省兰州市众泰养殖有限公司进行，预试期10 d，正试期60 d。试验动物分组混合饲喂，每日喂料2次，08：00和17：00各饲喂1次，自由采食，自由饮水，定期免疫驱虫。

1.3 指标测定及样品采集

黄芪副产物及饲粮中干物质、粗灰分、粗脂肪、粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙和磷含量分别参照GB/T 6435—2014[13]、GB/T 6438—1992[14]、GB/T 6433—2006[15]、GB/T 6432—1994[16]、GB/T 20806—2006[17]、NY/T 1459—2007[18]、GB/T 6437—2002[19]和GB/T 6436—2002[20]的方法测定。

在试验初始和结束当天早晨对各组试验羊空腹称重，计算试验羊的平均日增重。试验期间，每天分组记录试验羊的日饲喂量和剩料量，计算平均干物质采食量[21]。试验期结束后每组选取3只羊，颈静脉放血处死，收集脾脏组织称其重量，计算脾脏指数。称重后迅速采集脾脏组织，将一部分脾脏组织样品放入高压处理过的1.5 mL EP管后迅速投于液氮中，之后转入-80 ℃冰箱保存用于提取组织总RNA和总蛋白；另一部分脾脏组织样品放入4%的多聚甲醛溶液中固定后用于制备石蜡组织切片。

表2 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

续表2项目 Items含量 Content营养水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)12.25代谢能 ME/(MJ/kg)9.81干物质 Dry matter90.17粗脂肪 Ether extract2.65粗蛋白质 Crude protein14.39中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber26.35酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber14.66钙 Calcium1.59磷 Phosphorus1.34

1.4 试验方法

1.4.1 总RNA提取与cDNA合成

使用Trizol试剂提取脾脏组织总RNA，用超微量分光光度计(Thermo Scientific，德国)检测总RNA浓度和纯度，然后按照反转录试剂盒(北京迪宁生物有限公司)的说明合成第1链cDNA。

1.4.2 qRT-PCR

从NCBI数据库下载绵羊TLR2、IRAK4和β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA序列，使用软件Oligo 6.0设计引物，然后用Blast软件对引物的特异性进行检测。引物由西安擎科生物公司合成，引物序列信息见表3。qRT-PCR扩增体系为20 μL，包括：上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×Fast qPCR Master Mixture (Green) 10 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL；扩增条件为：95 ℃ 120 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

1.4.3 Western Blot

用RIPA高效组织裂解液提取总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离变性的蛋白，然后将凝胶上的蛋白转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封闭2 h后分别加入兔源一抗TLR2(1∶1 000，北京博奥森生物公司)、IRAK4(1∶1 000，北京博奥森生物技术有限公司)和β-actin(1∶1 500，北京博奥森生物技术有限公司)，4 ℃孵育过夜。PBST洗膜后加入二抗(1∶5 000，北京博奥森生物技术有限公司)37 ℃孵育2 h。PBST洗膜后，在X光室中使用底物化学发光试剂(electrochemi-luminescence，ECL)对蛋白的阳性信号进行可视化。

表3 引物序列信息

1.4.4 免疫组织化学染色

将石蜡切片65 ℃烤片3～5 h后，进行脱蜡、脱水、抗原修复处理。按照免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)的操作说明滴加3%过氧化氢(H2O2)室温孵育抑制内源性过氧化物酶的活性；用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加试剂A(封闭液)室温封闭30 min，甩掉试剂A，滴加一抗TLR2(1∶500)和IRAK4(1∶250)4 ℃过夜，用PBS代替一抗作阴性对照。PBS洗涤后滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗涤后用二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水终止后脱水、透明、封片、镜检照相。

1.5 数据统计分析

采用2-ΔΔCt方法[22]计算TLR2和IRAK4的mRNA的相对表达量。用AlphaEaseFC图像分析软件扫描TLR2和IRAK4蛋白的灰度。采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊生长性能的影响

由表4可知，在绵羊饲粮中添加不同比例的黄芪副产物后，各组绵羊的终末体重、平均日增重和平均干物质采食量差异不显著(P>0.05)。

表4 饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊生长性能的影响

2.2 饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊脾脏指数的影响

由表5可知，在绵羊饲粮中添加不同比例的黄芪副产物后，2%组绵羊的脾脏指数显著高于对照组、4%组和6%组(P<0.05)，而4%组和6%组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。

表5 饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊脾脏指数的影响

2.3 饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊脾脏中TLR2和IRAK4的mRNA相对表达量的影响

由图1可知，TLR2和IRAK4的mRNA在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏中均有表达，且表达趋势相似，其mRNA相对表达量随着黄芪副产物添加比例的增加而降低。2%组TLR2的mRNA相对表达量显著高于对照组、4%组和6%组(P<0.05)，对照组、4%组和6%组之间差异不显著(P>0.05)。2%组IRAK4的mRNA相对表达量显著高于对照组、4%组和6%组(P<0.05)；4%组IRAK4的mRNA相对表达量显著高于6%组(P<0.05)，但与对照组差异不显著(P>0.05)；6%组IRAK4的mRNA相对表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。

数据柱标注相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2同。

2.4 饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊脾脏中TLR2和TLR4蛋白相对表达量的影响

由图2可知，TLR2和IRAK4蛋白在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏中均有表达，且呈现出与mRNA相似的表达趋势。2%组TLR2蛋白相对表达量最高，且显著高于对照组、4%组和6%

组(P<0.05)，4%组和6%组显著高于对照组(P<0.05)。2%组IRAK4蛋白相对表达量最高，且显著高于对照组、4%组和6%组(P<0.05)；4%组IRAK4蛋白相对表达量显著高于对照组和6%组(P<0.05)，6%组与对照组差异不显著(P>0.05)。

图2 饲粮中添加不同比例黄芪副产物对绵羊脾脏中TLR2和IRAK4蛋白相对表达量的影响

2.5 TLR2和IRAK4蛋白在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏中的定位

由图3可知，运用免疫组织化学染色的方法检测TLR2和IRAK4蛋白在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏中的定位，结果发现，TLR2蛋白的免疫阳性信号主要定位在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏红髓的脾窦中，IRAK4蛋白的免疫阳性信号主要定位在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏红髓的脾索中，且2%组的免疫阳性信号较高。

A1～A4：对照组、2%组、4%组和6%组脾脏中TLR2蛋白的免疫组织化学染色结果(400×)；B1～B4：对照组、2%组、4%组和6%组脾脏中IRAK4蛋白的免疫组织化学染色结果(400×)；C1～C4：对照组、2%组、4%组和6%组阴性对照(400×)；C：脾索，S：脾窦。

3 讨 论

黄芪药材生产过程中产生的副产物具有较高的营养物质，其含有与其药用部位相似的化学组分[23]。黄芪的有效成分主要是黄芪多糖，黄芪多糖可以通过调节宿主免疫器官、免疫细胞及免疫分子，促进特异性与非特异性免疫以及多种信号通路作用，增强机体免疫力[24]。研究发现，饲粮中添加一定比例的黄芪可以促进动物生长发育、增加免疫器官质量、提高免疫器官指数、改善抗氧化能力和增强机体免疫力[25]。体增重是衡量绵羊生长性能的重要指标。本试验结果发现，绵羊饲粮中添加不同比例的黄芪副产物后各组羔羊的平均日增重和平均干物质采食量差异不显著，这表明饲粮中添加不同比例的黄芪副产物对绵羊生长发育无显著影响。免疫器官的重量是反映机体非特异性免疫功能的重要指标，脾脏指数能反映免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况[26]。马发顺等[27]研究发现，饲粮中添加黄芪多糖可以显著提高免疫器官指数。本试验结果表明，饲粮中添加2%黄芪副产物可显著提高绵羊的脾脏指数，饲粮中添加4%和6%黄芪副产物对绵羊的脾脏指数无显著影响，这表明基础饲粮中添加2%的黄芪副产物可以促进机体免疫器官发育。

TLR信号通路在先天免疫系统中发挥重要的作用。研究发现，IRAK4是调控IRAK1生物活性以及其他信号转导的关键分子，在TLR介导的信号通路中起重要的免疫调控作用[28]。研究表明，营养物质可以调控TLR信号通路相关基因的表达水平[29-30]。王海鹰[31]研究发现，灵芝多糖可以通过TLR2通路来激活NF-κB信号。韩乾杰[32]研究表明，黄芪多糖可以提高断奶仔猪生长性能，增强仔猪免疫功能，并通过调节肠道TLR4/NF-κB信号通路缓解机体过度免疫应激。为了探究饲粮中添加不同比例黄芪副产物是否调控TLR2信号通路相关基因的表达水平，本研究检测了TLR2和IRAK4 mRNA在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏中的相对表达量，结果显示，TLR2和IRAK4 mRNA在所有检测的绵羊脾脏组织中均有表达，饲喂黄芪副产物的绵羊脾脏中TLR2和IRAK4的mRNA相对表达量均高于对照组，且以2%组最高，其表达量随着黄芪副产物添加比例的增加而降低。对饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏中TLR2和IRAK4蛋白表达进行检测，结果发现，TLR2和IRAK4蛋白的表达趋势与mRNA的表达趋势一致，2%组TLR2和IRAK4蛋白的相对表达显著高于对照组，随着黄芪副产物添加比例的升高，其表达量呈降低趋势，与杨茹茜[33]的研究结果基本一致。本试验结果表明，饲粮中添加一定比例的黄芪副产物可以增加机体TLR2和IRAK4的mRNA相对表达量，且添加比例为2%时的效果最好。王宪举等[34]的研究发现，黄芪添加量过高时会导致动物采食过多次生功能性物质，从而抑制家畜营养利用。Guo等[35]在鹌鹑饲粮中添加1%、3%和5%的黄芪茎叶，结果发现饲粮中添加3%的黄芪茎叶在整个试验期间能显著提高平均日增重和平均日采食量，并促进免疫器官发育。这些研究结果表明饲粮中添加适宜比例的黄芪可以促进机体生长发育和提高免疫力，而添加过量的黄芪会对机体造成负影响[36]。本试验随着黄芪副产物添加比例的增加绵羊脾脏指数以及TLR2和IRAK4的mRNA相对表达量呈降低趋势，这可能是随着黄芪副产物添加比例的增加，绵羊采食过多次生功能性物质，抑制了营养利用，对机体造成了负影响。

TLR是一类普遍存在于天然免疫系统中的模式识别受体，通常表达于巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的表面[37]。研究发现，黄芪多糖能增加巨噬细胞的数量，增强巨噬细胞的吞噬作用，提高自然杀伤细胞的活性[38-39]。通过细胞定位发现，TLR2蛋白的免疫阳性信号主要分布在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏红髓脾窦中，IRAK4蛋白的免疫阳性信号主要分布在饲喂不同比例黄芪副产物绵羊脾脏红髓脾索中，其中2%组的免疫阳性信号较高。脾脏是机体最大的外周免疫器官，主要由3部分组成：白髓、红髓和边缘区，每一部分都含有大量的免疫细胞[40]。研究发现，植物多糖可通过与免疫细胞表面的多种受体结合，激活不同的信号通路来调控动物机体的免疫系统，其中TLR2可以结合糖基配体，介导免疫细胞激活细胞内信号通路，参与免疫调节[41]。据此推测，黄芪副产物对机体免疫机能的调控可能是通过与红髓内免疫细胞的受体TLR2结合激活信号通路，刺激下游IRAK4基因的表达，从而发挥免疫调节作用。但是，黄芪副产物对机体具体免疫机制尚需进行更深入的探究。

4 结 论

基础饲粮中添加2%的黄芪副产物不仅可以增加绵羊的脾脏指数，还可以上调脾脏中TLR2和IRAK4基因的表达，从而在机体的免疫调节中发挥作用。